本文關鍵詞：氧化應激下RPE細胞外泌體對RPE細胞Akt、VEGF-A表達的影響

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【摘要】：目的本研究通過分離提取氧化應激狀態(tài)下視網(wǎng)膜色素上皮細胞(Retinal Pigment Epithelium cells,RPE)分泌的外泌體(exosome),探索分析此外泌體對于正常RPE細胞增殖及細胞因子VEGF-A、Akt的影響,為RPE細胞外泌體與年齡相關性黃斑變性(AMD)發(fā)病機制的相關性提供實驗依據(jù)。方法1、培養(yǎng)人視網(wǎng)膜色素上皮細胞(ARPE-19),收集上清液,通過3種方法分離提取外泌體:超速差速離心法、Exosome提取試劑盒(SBI)、size exclusion qEV法,透射電鏡下觀察外泌體形態(tài),蛋白質(zhì)免疫印跡法(Western blot)檢測外泌體表面特異性標志蛋白CD63。細胞培養(yǎng)基中分別加入濃度為0、1、2.5、5μmol/L魚藤酮模擬氧化應激損傷,觀察分析不同濃度魚藤酮對細胞增殖情況的影響。2、選定2.5μmol/l魚藤酮誘導ARPE-19細胞損傷,制備氧化應激損傷下ARPE-19-exosome。外泌體與正常ARPE-19細胞共培養(yǎng),采用MTT法檢測細胞增殖活力。Western blot法、免疫熒光檢測共培養(yǎng)后ARPE-19細胞中細胞因子Akt、VEGF-A在蛋白水平表達的變化。RT-PCR檢測共培養(yǎng)后ARPE-19細胞的VEGF-A、Akt mRNA的表達。統(tǒng)計方法:實驗數(shù)據(jù)使用SPSS18.0軟件進行統(tǒng)計分析。所有計量資料數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標準差表示,MTT實驗各組的總體差異采用單因素方差分析,組間比較采用LSD-t檢驗,其余兩組組間比較采用配對樣本t檢驗,p0.05認為差異具有顯著性。結(jié)果1、正常ARPE-19細胞分泌的外泌體,形態(tài)呈圓形或近似圓形的小囊泡,直徑在50-150nm之間。蛋白質(zhì)免疫印跡法結(jié)果顯示,外泌體表達表面特異性標記蛋白CD63。MTT比色法檢測細胞增殖能力結(jié)果顯示魚藤酮對ARPE-19細胞增殖有抑制作用,隨魚藤酮濃度增加,抑制作用增大,差異具有顯著性(p0.05)。2、選取2.5μmol/L魚藤酮成功誘導ARPE-19細胞氧化應激損傷,ARPE-19-exosome與正常ARPE-19細胞共培養(yǎng)后,MTT法檢測與對照組相比,發(fā)現(xiàn)其對細胞增殖有抑制作用,差異有顯著性(p=0.002)。熒光顯微鏡下觀察,胞漿內(nèi)的綠熒光,與對照組相比,VEGF-A表達較強,Akt表達較弱。Western blot實驗結(jié)果顯示氧化應激作用下ARPE-19-exosome處理組細胞因子Akt表達低于對照組(p=0.003),細胞因子VEGF-A表達高于對照組(p=0.001),差異有顯著性(p0.05)。RT-PCR結(jié)果顯示,VEGF-A mRNA表達實驗組(2.37±0.43)高于對照組(0.54±0.07),Akt mRNA表達實驗組(0.64±0.11)低于對照組(3.05±0.58),差異具有顯著性(p0.05)。結(jié)論ARPE-19細胞分泌具有生物學功能的外泌體,氧化應激作用下ARPE-19細胞分泌外泌體可抑制正常AREP-19細胞的增殖,上調(diào)VEGF-A的表達,下調(diào)Akt的表達。
【關鍵詞】：外泌體 視網(wǎng)膜色素上皮細胞 氧化應激 VEGF-A Akt
【學位授予單位】：天津醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R774.5
【目錄】：

• 中文摘要4-6
• Abstract6-11
• 縮略語11-13
• 前言13-16
• 研究現(xiàn)狀、成果13-15
• 研究目的、方法15-16
• 一、氧化應激狀下ARPE-19外泌體制備16-28
• 1.1 對象和方法16-22
• 1.1.1 對象16-18
• 1.1.1.1 細胞來源16
• 1.1.1.2 主要儀器16
• 1.1.1.3 主要試劑16-17
• 1.1.1.4 主要試劑的配置17-18
• 1.1.2 方法18-22
• 1.1.2.1 正常ARPE-19細胞的培養(yǎng)18-19
• 1.1.2.1.1 細胞復蘇18
• 1.1.2.1.2 細胞培養(yǎng)及傳代18
• 1.1.2.1.3 細胞凍存18-19
• 1.1.2.2 正常ARPE-19細胞外泌體的分離提取19
• 1.1.2.2.1 超速差速離心法19
• 1.1.2.2.2 Exosome提取試劑盒(SBI)19
• 1.1.2.2.3 Exclusion qEV法19
• 1.1.2.3 外泌體的鑒定19-21
• 1.1.2.3.1 透射電鏡觀察外泌體形態(tài)19-20
• 1.1.2.3.2 Western blot法檢測外泌體表面特異標志蛋白CD6320-21
• 1.1.2.4 魚藤酮誘導ARPE-19細胞氧化應激損傷21-22
• 1.1.3 統(tǒng)計學分析22
• 1.2 結(jié)果22-24
• 1.2.1 正常ARPE-19細胞形態(tài)22
• 1.2.2 正常ARPE-19細胞外泌體形態(tài)特征及鑒定結(jié)果22-23
• 1.2.3 不同濃度魚藤酮對ARPE-19細胞增殖的影響23-24
• 1.3 討論24-27
• 1.3.1 外泌體的生物學特征24-26
• 1.3.2 視網(wǎng)膜色素上皮細胞與氧化應激26-27
• 1.4 小結(jié)27-28
• 二、氧化應激下ARPE-19細胞外泌體對其Akt、VEGF-A影響28-41
• 2.1 對象和方法28-32
• 2.1.1 對象28-29
• 2.1.1.1 材料28
• 2.1.1.2 主要儀器28
• 2.1.1.3 主要試劑28-29
• 2.1.1.4 主要試劑的配置29
• 2.1.2 方法29-32
• 2.1.2.1 氧化應激下ARPE-19細胞外泌體的制備29
• 2.1.2.2 BCA法檢測外泌體濃度29-30
• 2.1.2.3 外泌體與ARPE-19細胞共培養(yǎng)30
• 2.1.2.4 MTT法檢測細胞增殖活力30
• 2.1.2.5 免疫熒光染色檢測Akt與VEGF-A的表達30
• 2.1.2.6 Western blot法檢測Akt與VEGF-A的表達30
• 2.1.2.7 RT-PCR檢測Akt與VEGF-A的表達30-32
• 2.1.3 統(tǒng)計學分析32
• 2.2 結(jié)果32-36
• 2.2.1 外泌體共培養(yǎng)后ARPE-19細胞形態(tài)32-33
• 2.2.2 MTT檢測細胞增殖能力33
• 2.2.3 細胞免疫熒光檢測ARPE-19細胞中Akt及VEGF-A的表達33-35
• 2.2.4 western blot檢測外泌體對Akt、VEGF-A蛋白表達的影響35
• 2.2.5 RT-PCR檢測ARPE-19細胞中Akt與VEGF-A的表達35-36
• 2.3 討論36-40
• 2.3.1 AMD與氧化應激36-37
• 2.3.2 AKT與VEGF-A的生物學特性37-39
• 2.3.3 外泌體的免疫調(diào)節(jié)作用39-40
• 2.4 小結(jié)40-41
• 全文結(jié)論41-42
• 參考文獻42-49
• 發(fā)表論文和參加科研情況說明49-50
• 綜述 外泌體在年齡相關性黃斑變性發(fā)病機制中的研究進展50-58
• 綜述參考文獻54-58
• 致謝58-59
• 個人簡歷59

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前3條

1 梁厚成;陳凌;馮海曉;何玲;姚亮;柏凌;;視網(wǎng)膜色素上皮細胞氧化應激相關microRNA的鑒定[J];國際眼科雜志;2015年09期

2 廖志雄;樓正青;肖中;;兔房水來源exosomes的分離與鑒定及其免疫抑制功能的研究[J];浙江大學學報(醫(yī)學版);2012年03期

3 柏凌;閆歡歡;張德秀;王建明;孫乃學;;氧化應激對人視網(wǎng)膜色素上皮細胞屏障功能的影響及其分子機制研究[J];中華眼科雜志;2012年05期

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本文編號：1018294