本文關(guān)鍵詞：腸三葉因子減輕燒傷內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激促進腸上皮細胞谷氨酰胺轉(zhuǎn)運的機制

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【摘要】：研究背景及目的大面積嚴重?zé)齻艘鹌つw損毀之外還可導(dǎo)致多種內(nèi)臟功能嚴重受損,其中胃腸道是燒傷后受損最為嚴重的器官之一。燒傷后缺血缺氧性損害是導(dǎo)致胃腸道受損的首要原因,缺血缺氧不僅直接導(dǎo)致胃腸道組織結(jié)構(gòu)受損,還可因缺氧造成的能量代謝障礙加重黏膜受損,抑制黏膜修復(fù)。相關(guān)研究表明,小腸所需的主要能源物質(zhì)是谷氨酰胺(glutamine,Gln)而非葡萄糖。Gln能夠促進腸黏膜修復(fù),改善腸道功能。系列研究已證實,燒傷動物和患者給予Gln后能明顯改善腸道能量代謝,促進ATP合成,進而減輕腸黏膜受損程度,促進黏膜修復(fù),改善腸道功能。已有研究表明,嚴重創(chuàng)傷、感染及膿毒癥等情況下,腸道對Gln的轉(zhuǎn)運能力降低。燒傷屬于嚴重創(chuàng)傷,有理由相信燒傷與創(chuàng)傷具有類似的病理生理變化。腸三葉因子(Intestinal trefoil factor,ITF)是杯狀細胞分泌的腸道特異的生長因子,能減輕燒傷后腸黏膜損傷,但是否能改善燒傷后腸道對Gln的轉(zhuǎn)運目前尚不清楚。本研究將著重探討嚴重?zé)齻竽c上皮細胞對谷氨酰胺轉(zhuǎn)運能力的變化規(guī)律以及ITF對其的影響,并探討其分子機制。研究方法1.動物實驗:將120只Sprague-dawley大鼠隨機分為正常對照組(Control),燒傷對照組(Burn),燒傷+ITF治療組(Burn+ITF)。所有大鼠均給予腹腔注射苯巴比妥鈉(40mg/kg.weight)麻醉,然后皮下注射鎮(zhèn)痛劑丁丙諾啡(0.05 mg/kg body weight),使用推毛機剃除背部和兩側(cè)體毛,露出30%體表面積以供燙傷。Control組大鼠置于37℃水浴中18秒模擬燙傷模型,其余各組大鼠置于97℃水浴中18秒制作30%體表面積Ⅲ°燒傷大鼠模型。傷后各組均立即腹腔注射乳酸林格液(40m L/kg.weight)復(fù)蘇,燙傷大鼠置于烤溫架待其蘇醒,各組均給予正常飲食及飲水。Burn+ITF組于燙傷后6小時灌胃給予ITF(1mg/kg.d),其余各組灌胃等體積生理鹽水。各組大鼠分別于燙傷后(post burn day,PBD)1、3、5、7天處死大鼠,取出小腸,提取大鼠小腸上皮細胞及其紋狀緣囊泡。采用鈣離子螯合法提取大鼠小腸上皮細胞(intestinal epithelial cells,IECs),采用Mg2+低溫差速離心法制備大鼠小腸紋狀緣囊泡(brush-border membrane viscles,BBMVs),同位素計數(shù)法檢測通過IECs和BBMVs的[3H]-glutamine的放射性強度,計算出IECs和BBMVs對[3H]-Gln的轉(zhuǎn)運率。采用透射電子顯微鏡觀察BBMVs的形態(tài)學(xué)變化,western blot檢測大鼠IECs中Gln轉(zhuǎn)運載體ASCT2,B~0AT1及其相關(guān)調(diào)控蛋白表達量的變化。2.細胞實驗:體外培養(yǎng)大鼠小腸上皮細胞株IEC-6,采用10%燒傷大鼠血清培養(yǎng)IEC-6模擬細胞燒傷模型。實驗分為正常對照組(Control),燒傷對照組(Burn),燒傷大鼠血清與ITF(10μg/m L)共培養(yǎng)組(Burn+ITF),燒傷大鼠血清+ITF(10μg/m L)+Compound C(10μmol/L)共培養(yǎng)組(Burn+ITF+Cp C),燒傷大鼠血清+ITF(10μg/m L)+3-MA(5mmol/L)共培養(yǎng)組(Burn+ITF+3-MA),燒傷大鼠血清+ITF(10μg/m L)+16F16(10μmol/L)共培養(yǎng)組(Burn+ITF+16F16)。采用同位素計數(shù)法檢測通過IEC-6的[3H]-glutamine的放射性強度,計算出IEC-6對Gln的轉(zhuǎn)運率,western blot檢測IEC-6中Gln轉(zhuǎn)運載體ASCT2,B~0AT1及其相關(guān)調(diào)控蛋白表達量的變化。實驗結(jié)果1.嚴重?zé)齻蟠笫驣ECs和BBMVs對Gln的轉(zhuǎn)運能力均明顯降低,其中Na+依賴性轉(zhuǎn)運載體介導(dǎo)的Gln轉(zhuǎn)運降低的幅度更為明顯,非Na+依賴性載體轉(zhuǎn)運Gln的變化趨勢除傷后1-3天外,其他時相點均明顯高于傷前。2.正常大鼠腸上皮細胞轉(zhuǎn)運Gln的部位主要位于紋狀緣,大約占總量的65%。嚴重?zé)齻笤摫壤蠓陆�。腸上皮細胞以及BBMVs對Gln的轉(zhuǎn)運主要依靠Na+依賴性載體,該載體在腸上皮細胞以及BBMVs中介導(dǎo)的Gln轉(zhuǎn)運量分別占總轉(zhuǎn)運量的75%和85%,燒傷后該比例降至55%和60%,降幅均達25%左右。3.給予ITF能夠明顯促進燒傷后大鼠IECs及BBMVs對Gln的轉(zhuǎn)運。在兩型轉(zhuǎn)運載體中,ITF主要影響Na+依賴型轉(zhuǎn)運載體的活性,對非Na+依賴型載體的影響則不明顯。ITF提高了Na+依賴型Gln轉(zhuǎn)運載體的活性,進而提高了腸上皮細胞和BBMVs中該型載體轉(zhuǎn)運Gln所占的比例。4.嚴重?zé)齻?BBMVs空間結(jié)構(gòu)嚴重受損,表現(xiàn)為形態(tài)極不規(guī)則,囊泡破損,泡壁塌陷,邊緣毛糙,鏡下可見諸多囊泡破損碎片;給予ITF 5天能夠明顯改善BBMVs形態(tài),直至給藥7天,其形態(tài)已接近正常,泡膜結(jié)構(gòu)完整,泡腔飽滿,整體輪廓清晰,但邊緣仍顯毛糙。5.嚴重?zé)齻?-7天,大鼠IECs中Na+依賴型Gln轉(zhuǎn)運載體ASCT2、B~0AT1蛋白合成量均明顯降低,給予ITF能夠明顯促進ASCT2及B~0AT1合成,至給藥7天,ASCT2、B~0AT1已基本恢復(fù)正常水平。6.嚴重?zé)齻?-5天,大鼠IECs中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激標志蛋白CHOP表達明顯升高,PDI表達明顯降低;給予ITF能夠明顯抑制CHOP表達,同時提高PDI表達水平。7.嚴重?zé)齻?大鼠IECs中AMPK磷酸化水平明顯降低,自噬水平升高;給予ITF能夠上調(diào)AMPK磷酸化水平,自噬水平升高幅度更大。8.燒傷血清培養(yǎng)IEC-6細胞12h,ASCT2、B~0AT1、PDI蛋白水平和AMPK磷酸化水平均明顯降低,同時,CHOP表達量、LC3-II/I值升高,IEC-6細胞對Gln的轉(zhuǎn)運能力降低。給予ITF能夠降低CHOP表達,增大LC3-II/I升高幅度,同時通過上調(diào)PDI、ASCT2、B~0AT1蛋白表達水平,促進IEC-6對Gln的轉(zhuǎn)運能力。無論是抑制PDI,自噬,還是AMPK磷酸化,均可以抵消ITF對IEC-6細胞的生物學(xué)活性。結(jié)論1.大鼠腸上皮細胞及BBMVs對Gln的轉(zhuǎn)運主要依靠鈉依賴型載體,嚴重?zé)齻?IECs及BBMVs中鈉依賴性Gln轉(zhuǎn)運明顯降低。ITF能夠通過促進IECs及BBMVs中鈉依賴性Gln轉(zhuǎn)運從而提高燒傷后大鼠腸上皮細胞對Gln的轉(zhuǎn)運。2.ITF通過提高腸上皮細胞中鈉依賴型Gln轉(zhuǎn)運載體ASCT2、B~0AT1的蛋白表達水平,進而提高IECs對Gln的轉(zhuǎn)運。3.ITF還通過維護燒傷后BBMVs的形態(tài)結(jié)構(gòu)促進腸上皮細胞對Gln的轉(zhuǎn)運。4.ITF通過上調(diào)燒傷后AMPK磷酸化水平,增強自噬,減輕內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激,維護PDI的含量,促進ASCT2、B~0AT1形成正確的空間結(jié)構(gòu),最終促進腸道對Gln的轉(zhuǎn)運。
【關(guān)鍵詞】：燒傷 谷氨酰胺 腸三葉因子 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激 自噬 AMPK ASCT2 B~0AT1 PDI
【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R644
【目錄】：

• 縮略語表4-5
• 英文摘要5-9
• 中文摘要9-12
• 1. 前言12-14
• 2. 材料與方法14-17
• 3. 實驗方法17-21
• 4. 結(jié)果21-39
• 5. 討論39-45
• 全文結(jié)論45-46
• 參考文獻46-51
• 文獻綜述 自噬在維護腸道穩(wěn)定中的作用51-60
• 參考文獻55-60
• 在讀碩士期間發(fā)表文章60-61
• 致謝61

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