本文關(guān)鍵詞：嗜酸乳桿菌對(duì)重型顱腦損傷小鼠腸道平滑肌鈣依賴性通路影響的研究

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【摘要】：腸動(dòng)力不足(Intestinal motility deficiency,IMD)是重型顱腦損傷(Severe head injury,SHI)后常見(jiàn)的并發(fā)癥。如果不能在早期進(jìn)行有效的防治,可引起腸道菌群紊亂、加重機(jī)體炎癥反應(yīng),甚至誘發(fā)多器官功能障礙綜合征。目前臨床用于防治IMD的藥物均存在一定的副作用。近年來(lái),益生菌在危重癥患者治療中的作用受到關(guān)注。研究表明,益生菌不僅能糾正嚴(yán)重創(chuàng)傷患者的腸道菌群失調(diào),還具有改善腸動(dòng)力的作用。但迄今大多數(shù)研究?jī)H觀察了用益生菌后的效果,對(duì)其改善腸動(dòng)力相關(guān)機(jī)制的研究較少。平滑肌細(xì)胞的收縮舒張是腸動(dòng)力的最終效應(yīng)器,而鈣依賴性通路是調(diào)控平滑肌細(xì)胞收縮的重要通路。當(dāng)細(xì)胞受到外界刺激時(shí)胞外Ca~(2+)可經(jīng)細(xì)胞膜上的Cav1.2鈣離子通道流入細(xì)胞內(nèi),同時(shí)胞內(nèi)鈣庫(kù)也會(huì)通過(guò)肌質(zhì)網(wǎng)膜上的IP3R、RyR3釋放部分Ca~(2+),使胞內(nèi)游離的Ca~(2+)濃度升高,Ca~(2+)與Ca M、MLCK形成Ca~(2+)/Ca M/MLCK復(fù)合物,最終使MLC20磷酸化,引起平滑肌收縮。由此可見(jiàn),MLC20的磷酸化水平與平滑肌細(xì)胞的收縮有密切的關(guān)系。此外,研究還發(fā)現(xiàn)PKC在調(diào)節(jié)MLC20磷酸化水平及腸道平滑肌收縮中也至關(guān)重要。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)嗜酸乳桿菌可改善SHI小鼠腸道平滑肌的收縮功能,本研究在此基礎(chǔ)上采用SHI小鼠腸動(dòng)力不足模型,以調(diào)節(jié)腸道平滑肌收縮的鈣依賴性通路為切入點(diǎn),分別在給SHI小鼠灌胃嗜酸乳桿菌1d、3d、7d后觀察其腸道平滑肌鈣依賴性通路中信號(hào)分子的變化,初步揭示嗜酸乳桿菌改善SHI小鼠腸動(dòng)力不足的可能機(jī)制。本課題旨在為嗜酸乳桿菌用于創(chuàng)傷領(lǐng)域提供實(shí)驗(yàn)證據(jù),同時(shí)對(duì)探討益生菌改善腸動(dòng)力的相關(guān)機(jī)制提供參考依據(jù)。研究目的觀察SHI后小鼠腸道平滑肌鈣依賴性通路信號(hào)分子的表達(dá)變化,明確嗜酸乳桿菌對(duì)傷后小鼠腸道平滑肌鈣依賴性通路的影響,初步揭示嗜酸乳桿菌改善SHI小鼠腸動(dòng)力不足的分子機(jī)制。實(shí)驗(yàn)方法本研究將90只健康雄性C57BL/6小鼠(18-24g)隨機(jī)分為假傷組、損傷組和損傷+嗜酸乳桿菌組(每組30只)。每組小鼠均分為1d、3d、7d三個(gè)時(shí)相點(diǎn)(每一時(shí)相點(diǎn)10只小鼠)。各組小鼠均用5%的水合氯醛進(jìn)行腹腔麻醉。損傷組和損傷+嗜酸乳桿菌組均采用改良的Feeney’s自由落體撞擊法建立SHI后腸動(dòng)力不足小鼠模型。假傷組只開(kāi)骨窗,不進(jìn)行打擊。傷后約4h待小鼠清醒后開(kāi)始灌胃。假傷組及損傷組小鼠灌胃0.5ml嗜酸乳桿菌培養(yǎng)基溶液,損傷+嗜酸乳桿菌組灌胃相同體積的嗜酸乳桿菌混懸液(約含菌1×1010CFU)。每天灌胃一次,其余時(shí)間均自由飲食水。分別在傷后1d、3d、7d留取末端回腸(距盲腸1.5cm)。蛋白免疫印跡法(Western blotting)檢測(cè)20KDa肌球蛋白輕鏈(MLC20)的磷酸化水平。酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA)及免疫組織化學(xué)染色技術(shù)檢測(cè)肌球蛋白輕鏈激酶(MLCK)的表達(dá)量,ELISA檢測(cè)MLCK的活性。ELISA檢測(cè)PKC蛋白水平、L型鈣離子通道Cav1.2、三磷酸肌醇受體(IP3R)、雷諾定受體(RyR3)的表達(dá)量。主要結(jié)果1.MLC20磷酸化水平變化Western blotting結(jié)果:與假傷組相比較,MLC20在SHI后1d、3d、7d的磷酸化水平均明顯降低(損傷組vs假傷組,1d,3d,7d:P0.05);嗜酸乳桿菌灌胃1d、3d、7d后SHI小鼠腸道平滑肌MLC20的磷酸化水平顯著升高(損傷+嗜酸乳桿菌組vs損傷組,1d,3d,7d:P0.05)。2.MLCK表達(dá)量及活性變化ELISA及免疫組化結(jié)果:MLCK在SHI后1d、3d、7d的蛋白濃度均明顯低于假傷組(損傷組vs假傷組,1d,3d,7d:P0.05);嗜酸乳桿菌干預(yù)1d、3d、7d后MLCK的濃度均顯著高于損傷組(損傷+嗜酸乳桿菌組vs損傷組,1d,3d,7d:P0.01)。同時(shí),傷后1d、3d、7d的MLCK活性均低于相同時(shí)相點(diǎn)假傷組MLCK的活性(損傷組vs假傷組,1d,3d,7d:P0.01);嗜酸乳桿菌干預(yù)1d、3d和7d后MLCK的活性顯著增強(qiáng),且與損傷組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(損傷+嗜酸乳桿菌組vs損傷組,1d,3d,7d:P0.05)。3.PKC蛋白水平變化ELISA結(jié)果:SHI后1d、3d、7d的PKC水平明顯高于假傷組相同時(shí)間點(diǎn)PKC的水平(損傷組vs假傷組,1d,3d,7d:P0.05);嗜酸乳桿菌灌胃1d、3d、7d后SHI小鼠腸道平滑肌PKC水平顯著降低(損傷+嗜酸乳桿菌組vs損傷組,1d,3d,7d:P0.05)。4.Cav1.2表達(dá)量變化ELISA結(jié)果:SHI后第1d及損傷3d和7d后,小鼠腸道平滑肌Cav1.2的表達(dá)量均明顯降低(損傷組vs假傷組,1d,3d,7d,P0.01);嗜酸乳桿菌干預(yù)1d、3d和7d后Cav1.2的表達(dá)量均顯著高于損傷組(損傷+嗜酸乳桿菌組vs損傷組,1d,3d,7d:P0.01)。5.IP3R表達(dá)量變化ELISA結(jié)果:IP3R在SHI后第1d及傷后3d和7d的表達(dá)量均明顯低于相同時(shí)相點(diǎn)假傷組IP3R的表達(dá)量(損傷組vs假傷組,1d,3d,7d,P0.01);IP3R在嗜酸乳桿菌灌胃1d后的表達(dá)量雖有升高,但與損傷組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(損傷+嗜酸乳桿菌組vs損傷組,1d:P0.05),嗜酸乳桿菌灌胃3d和7d后SHI小鼠腸道平滑肌IP3R表達(dá)量顯著提高(損傷+嗜酸乳桿菌組vs損傷組,3d,7d:P0.01)。6.RyR3表達(dá)量變化ELISA結(jié)果:SHI后1d、3d、7d的RyR3表達(dá)水平均顯著降低(損傷組vs假傷組,1d,3d,7d,P0.01);嗜酸乳桿菌灌胃第1d及灌胃3d和7d后RyR3蛋白水平均有升高,但與損傷組相比差異均沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(損傷+嗜酸乳桿菌組vs損傷組,1d,3d,7d:P0.05)。結(jié)論1.SHI后小鼠腸道平滑肌鈣依賴性通路信號(hào)分子的表達(dá)水平發(fā)生異常變化。2.SHI后小鼠腸道平滑肌鈣依賴性通路中MLC20的磷酸化水平降低,MLCK的活性減弱、表達(dá)量下降。嗜酸乳桿菌可增強(qiáng)傷后MLCK的活性、提高M(jìn)LCK的表達(dá)量及MLC20的磷酸化水平。3.SHI后小鼠腸道平滑肌鈣依賴性通路中PKC的水平明顯升高,嗜酸乳桿菌可降低傷后PKC的蛋白水平。4.SHI后小鼠腸道平滑肌鈣離子通道Cav1.2、IP3R、RyR3表達(dá)量降低,嗜酸乳桿菌可提高傷后Cav1.2、IP3R、RyR3的表達(dá)水平。
【關(guān)鍵詞】：重型顱腦損傷 嗜酸乳桿菌 鈣依賴性通路
【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R651.15
【目錄】：

• 英文縮寫(xiě)表4-5
• 英文摘要5-9
• 中文摘要9-12
• 1. 前言12-15
• 2. 材料與方法15-28
• 3. 結(jié)果28-36
• 4. 討論36-42
• 全文總結(jié)42
• 創(chuàng)新點(diǎn)42
• 實(shí)驗(yàn)不足之處42-43
• 參考文獻(xiàn)43-48
• 文獻(xiàn)綜述 L型鈣通道結(jié)構(gòu)與功能研究進(jìn)展48-61
• 參考文獻(xiàn)55-61
• 碩士期間撰寫(xiě)與發(fā)表的文章61-62
• 致謝62

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