本文關(guān)鍵詞：Hippo在降鈣素基因相關(guān)肽調(diào)控小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖分化中的作用

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【摘要】：骨折愈合是一個復(fù)雜有序的過程,涉及諸多生物因子,如肽能神經(jīng)遞質(zhì)。降鈣素基因相關(guān)肽(Calcitonin gene-related peptide,CGRP)是一種在機(jī)體多個組織器官內(nèi)表達(dá)最廣泛的神經(jīng)多肽,已被證實(shí)具有促進(jìn)骨折后重塑的生物學(xué)功能,它的受體復(fù)合物包括:降鈣素受體樣受體(Calcitonin receptor like receptor,CRLR)、受體活性修飾蛋白(Receptor activity modifying protein,RAMP)、受體組分蛋白(Receptor component protein,RCP)~[1]。早在1987年就有研究報(bào)道,骨折合并中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷的患者,愈合時間比正常短;而合并周圍神經(jīng)系統(tǒng)損傷的患者,愈合時間明顯延長~[2]。之后的研究發(fā)現(xiàn),骨折患者血漿中CGRP濃度增加,骨折局部含CGRP的神經(jīng)元數(shù)目明顯增多~[3]。本課題組前期研究已經(jīng)證實(shí),CGRP可促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖、分化,抑制破骨細(xì)胞生成,促進(jìn)骨折修復(fù),許多信號途徑如c AMP/PKA、RANKL、BMP、NO/NOS等都參與了CGRP對骨折愈合過程的調(diào)控~[4,5]。但CGRP對成骨細(xì)胞、破骨細(xì)胞的前體細(xì)胞——骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(Bone mesenchymal stem cells,BMSCs)的成骨功能調(diào)控如何以及相關(guān)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的研究還鮮有報(bào)道。BMSCs來源于中胚層,具有容易分離培養(yǎng)、可塑性強(qiáng)、可多向分化、能夠在體外快速擴(kuò)增等優(yōu)點(diǎn),在骨組織工程中受到高度關(guān)注~[6]。有學(xué)者通過激光共聚焦發(fā)現(xiàn)小鼠BMSCs表面存在著CRLR和RAMP。同時,m RNA及蛋白水平檢測也證實(shí)了人BMSCs表面存在CGRP受體~[7,8]。Hippo信號通路具有高度保守性,對細(xì)胞調(diào)控的生物學(xué)功能表現(xiàn)為抑制細(xì)胞增殖、促進(jìn)細(xì)胞凋亡。Hippo通路的三大組成部分包括:上游信號分子(Ex,Mer等)、核心激酶級聯(lián)反應(yīng)鏈(Mst1/2、Lats1/2、Sav等)、下游效應(yīng)分子(Yap/Taz)。上游分子接收并傳遞外界信號,激活核心激酶鏈的磷酸化級聯(lián)反應(yīng),引起Yap/Taz的活性改變和核/質(zhì)轉(zhuǎn)位,最終激活或抑制下游靶基因的轉(zhuǎn)錄及相關(guān)蛋白表達(dá)~[9]。Hippo通路在哺乳動物中的驗(yàn)證開始于小鼠肝臟。研究人員過表達(dá)小鼠肝臟細(xì)胞內(nèi)的Yap基因后發(fā)現(xiàn)細(xì)胞增殖加快,肝臟體積達(dá)到正常肝臟的3-4倍。抑制Yap的表達(dá)后,肝細(xì)胞凋亡水平升高,肝臟最終恢復(fù)至正常大小~[10]。有報(bào)道指出,Mstl/2和Savl在維持肝細(xì)胞靜態(tài)和小鼠出生后限制肝臟生長具有重要作用~[11]。另外,值得注意的是,該通路在胚胎發(fā)育過程及成體干細(xì)胞分化命運(yùn)決定中也發(fā)揮了一定的調(diào)控作用~[12]。綜上所述,本文旨在進(jìn)一步揭示CGRP在骨折愈合中的作用,研究CGRP對小鼠BMSCs增殖及成骨分化的影響,并對Hippo通路在這個過程中發(fā)揮的作用進(jìn)行初步探討。研究方法:1、體外分離、培養(yǎng)、鑒定原代Balb/c小鼠BMSCs。2、在體外成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)的BMSCs中加入不同濃度的CGRP(10~(~(-1)0)、10~(-9)、10~(-8)、10~(-7)mol/L),處理48 h后測試堿性磷酸酶(ALP)活性,篩選的優(yōu)勢濃度。3、CGRP處理BMSCs7d后進(jìn)行茜素紅染色,檢測細(xì)胞的成骨分化情況。4、應(yīng)用Western blot檢測CGRP作用于BMSCs后,Hippo通路核心分子Mst1/2蛋白磷酸化的表達(dá)水平。5、利用Hippo通路抑制劑維替泊芬(Verteporfin)阻斷下游Yap信號,逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)檢測其對成骨相關(guān)因子Ⅰ型膠原蛋白(collagenⅠ)、Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2(Runx2)m RNA的表達(dá)影響。結(jié)果:1、成功分離并擴(kuò)增純化Balb/c小鼠BMSCs。2、ALP活性檢測結(jié)果顯示,與空白對照組相比,10~(-9)、10~(-8)、10~(-7) mol·L~(-1)濃度范圍的CGRP都能顯著促進(jìn)小鼠ALP活性的增加(P0.05),且以10~(-8) mol·L~(-1)濃度的CGRP為最佳刺激濃度。3、用10~(-8) mol·L~(-1)濃度的CGRP處理后,茜素紅染色顯示鈣化結(jié)節(jié)明顯增多。CGRP能夠顯著上調(diào)p-Mst1/2蛋白的表達(dá)(P0.05)。4、當(dāng)運(yùn)用了抑制劑Verteporfin時,顯著降低了CGRP誘導(dǎo)的Runx2、collagenⅠm RNA的表達(dá)(P0.05)。結(jié)論:1、通過貼壁篩選的手段可成功從Balb/c小鼠下肢骨骨髓中獲得所需的BMSCs。2、神經(jīng)肽CGRP能顯著地促進(jìn)小鼠BMSCs增殖和成骨分化,優(yōu)勢刺激濃度為10~(-8)mol/L。3、Hippo信號通路在CGRP促進(jìn)小鼠BMSCs成骨分化過程中起正向調(diào)控作用。
【關(guān)鍵詞】：降鈣素基因相關(guān)肽 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞 Hippo信號通路 骨折愈合 增殖 分化
【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R683
【目錄】：

• 縮略詞表4-6
• 英文摘要6-9
• 中文摘要9-11
• 第一章 前言11-13
• 第二章 原代小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分離、純化、鑒定13-19
• 2.1 材料與方法13-16
• 2.2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果16-18
• 2.3 討論18-19
• 第三章 降鈣素基因相關(guān)肽對小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖、分化的影響19-28
• 3.1 材料與方法19-22
• 3.2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果22-27
• 3.3 討論27-28
• 第四章 Hippo通路在降鈣素基因相關(guān)肽促小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化中的作用28-41
• 4.1 材料與方法28-36
• 4.2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果36-39
• 4.3 討論39-41
• 全文結(jié)論41-42
• 參考文獻(xiàn)42-44
• 文獻(xiàn)綜述 Hippo信號通路的研究進(jìn)展44-52
• 參考文獻(xiàn)48-52
• 攻讀碩士期間所發(fā)表的論文52-53
• 致謝53

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中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 ;Hippo signaling:A hub of growth control,tumor suppression and pluripotency maintenance[J];遺傳學(xué)報(bào);2011年10期

2 許傳銘;萬福生;;哺乳動物Hippo信號通路:腫瘤治療的新標(biāo)靶[J];遺傳;2012年03期

3 李敏睿;張盛洪;鐘碧慧;;Hippo信號通路在惡性腫瘤及干細(xì)胞中的作用[J];胃腸病學(xué)和肝病學(xué)雜志;2013年04期

4 朱忠勝;張春林;;腫瘤中Hippo-TAZ信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路研究進(jìn)展[J];國際骨科學(xué)雜志;2013年03期

5 史夢婕;邵松軍;李潔媚;周艷芳;黃培春;;Hippo通路與腫瘤相關(guān)性研究進(jìn)展[J];中國細(xì)胞生物學(xué)學(xué)報(bào);2014年03期

6 李桂蘭;張麗;閆華超;;Hippo信號通路與腫瘤發(fā)生相關(guān)性研究進(jìn)展[J];基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與臨床;2010年09期

7 鮑乾坤;何金龍;朱毅;;Hippo-YAP通路在心血管系統(tǒng)中的作用[J];生理科學(xué)進(jìn)展;2014年03期

8 Jiliang Zhou;;An emerging role for Hippo-YAP signaling in cardiovascular development[J];The Journal of Biomedical Research;2014年04期

9 Masato Enomoto;Tatsushi Igaki;;Deciphering tumor-suppressor signaling in flies:Genetic link between Scribble/Dlg/Lgl and the Hippo pathways[J];遺傳學(xué)報(bào);2011年10期

10 張靖;朱金水;;Hippo-YAP信號通路與胃癌相關(guān)性研究[J];國際消化病雜志;2011年04期

中國重要會議論文全文數(shù)據(jù)庫 前3條

1 Zhan Yang;;MicroRNA-155 and Hippo/STK3 Form a Feedback Loop to Participate in Vascular Smooth Muscle Cell Proliferation[A];中國生物化學(xué)與分子生物學(xué)會第十一次會員代表大會暨2014年全國學(xué)術(shù)會議論文集——專題報(bào)告五[C];2014年

2 Hongtan Wu;Luyao Wei;Suyuan Ji;Fuqin Fan;Funiu Qin;Lanfen Chen;Dawang Zhou;;MST1/2-Yap signaling pathway in organ size control and cancer development[A];生命的分子機(jī)器及其調(diào)控網(wǎng)絡(luò)——2012年全國生物化學(xué)與分子生物學(xué)學(xué)術(shù)大會摘要集[C];2012年

3 Zhan Yang;Bin Zheng;Yu Zhang;Xin-hua Zhang;Ming He;Dong Ma;Jin-kun Wen;;MicroRNA-155 and Hippo/STK3 Form a Feedback Loop to Participate in Vascular Smooth Muscle Cell Proliferation[A];第十二屆全國脂質(zhì)與脂蛋白學(xué)術(shù)會議論文匯編[C];2014年

中國重要報(bào)紙全文數(shù)據(jù)庫 前2條

1 記者 胡德榮;我學(xué)者發(fā)現(xiàn)原癌蛋白質(zhì)YAP抑制劑[N];健康報(bào);2014年

2 記者 徐瑞哲;人造“克星”抑制胃癌[N];解放日報(bào);2014年

中國博士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 安健;Nedd4-like E3泛素連接酶調(diào)控Angiomotin/p130蛋白穩(wěn)定性的分子機(jī)制研究[D];復(fù)旦大學(xué);2011年

2 劉歡;Hippo通路效應(yīng)蛋白YAP調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄的機(jī)制與功能研究[D];浙江大學(xué);2015年

3 劉鵬;HBV preS2 通過miR-338-3p 調(diào)控Hippo通路效應(yīng)分子TAZ促進(jìn)肝細(xì)胞肝癌作用研究[D];山東大學(xué);2015年

4 朱國華;上調(diào)miR-130b通過滅活Hippo信號通路來增強(qiáng)膠質(zhì)瘤干細(xì)胞的表型[D];新疆醫(yī)科大學(xué);2015年

5 韓笑;Hippo信號通路中TEAD蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能研究[D];吉林大學(xué);2016年

6 郭鵬達(dá);RARγ的缺失通過調(diào)控Hippo-Yap信號通路促進(jìn)結(jié)直腸癌的發(fā)生和轉(zhuǎn)移[D];蘇州大學(xué);2016年

7 周菁;YAP在哮喘發(fā)生過程中的表達(dá)情況及其功能探討[D];南昌大學(xué);2016年

8 鄧軍;CUL4A通過調(diào)控Hippo通路促胃癌細(xì)胞增殖和侵襲的分子機(jī)制[D];南昌大學(xué);2016年

9 李佳;Hippo信號通路在調(diào)節(jié)卵巢生殖干細(xì)胞功能和延緩卵巢衰老中的作用[D];南昌大學(xué);2016年

10 劉乃華;磷酸二酯酶5/PKG通過Hippo/TAZ信號調(diào)控前列腺癌腫瘤干細(xì)胞干性及其分子機(jī)制研究[D];浙江大學(xué);2016年

中國碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 王小燕;Alcf八個氨基酸差異選擇性剪接對核定位功能的影響及其抗體制備[D];重慶醫(yī)科大學(xué);2015年

2 陸亞紅;家蠶BmYki不同剪接體的功能研究[D];蘇州大學(xué);2016年

3 宋春暖;家蠶Hippo通路成員的全基因組鑒定與分析[D];西南大學(xué);2016年

4 王日遠(yuǎn);家蠶Hippo通路主基因BmYki的克隆、表達(dá)及功能初探[D];西南大學(xué);2016年

5 王曉霞;E-cadherin介導(dǎo)的麥冬皂苷B調(diào)控非小細(xì)胞肺癌Hippo通路的機(jī)制研究[D];南京中醫(yī)藥大學(xué);2016年

6 朱羽桐;癌基因TBC1D3的功能研究[D];浙江大學(xué);2016年

7 車聰;炎性因子通過抑制胃上皮細(xì)胞中Hippo-YAP信號通路促進(jìn)胃黏膜發(fā)生EMT改變[D];青島大學(xué);2016年

8 武亞楠;Hippo/TAZ信號通路在骨肉瘤耐藥過程中的機(jī)制研究[D];中國人民解放軍醫(yī)學(xué)院;2016年

9 孟煥然;Hippo通路相關(guān)蛋白在卵巢癌組織中的表達(dá)及其臨床意義[D];寧夏醫(yī)科大學(xué);2016年

10 蓋江南;Hippo通路在乳酸促進(jìn)肺腺癌轉(zhuǎn)移中作用的研究[D];天津醫(yī)科大學(xué);2016年

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本文編號：871120