本文關鍵詞：Hippo在降鈣素基因相關肽調控小鼠骨髓間充質干細胞增殖分化中的作用

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【摘要】：骨折愈合是一個復雜有序的過程,涉及諸多生物因子,如肽能神經(jīng)遞質。降鈣素基因相關肽(Calcitonin gene-related peptide,CGRP)是一種在機體多個組織器官內(nèi)表達最廣泛的神經(jīng)多肽,已被證實具有促進骨折后重塑的生物學功能,它的受體復合物包括:降鈣素受體樣受體(Calcitonin receptor like receptor,CRLR)、受體活性修飾蛋白(Receptor activity modifying protein,RAMP)、受體組分蛋白(Receptor component protein,RCP)~[1]。早在1987年就有研究報道,骨折合并中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷的患者,愈合時間比正常短;而合并周圍神經(jīng)系統(tǒng)損傷的患者,愈合時間明顯延長~[2]。之后的研究發(fā)現(xiàn),骨折患者血漿中CGRP濃度增加,骨折局部含CGRP的神經(jīng)元數(shù)目明顯增多~[3]。本課題組前期研究已經(jīng)證實,CGRP可促進成骨細胞增殖、分化,抑制破骨細胞生成,促進骨折修復,許多信號途徑如c AMP/PKA、RANKL、BMP、NO/NOS等都參與了CGRP對骨折愈合過程的調控~[4,5]。但CGRP對成骨細胞、破骨細胞的前體細胞——骨髓間充質干細胞(Bone mesenchymal stem cells,BMSCs)的成骨功能調控如何以及相關信號轉導通路的研究還鮮有報道。BMSCs來源于中胚層,具有容易分離培養(yǎng)、可塑性強、可多向分化、能夠在體外快速擴增等優(yōu)點,在骨組織工程中受到高度關注~[6]。有學者通過激光共聚焦發(fā)現(xiàn)小鼠BMSCs表面存在著CRLR和RAMP。同時,m RNA及蛋白水平檢測也證實了人BMSCs表面存在CGRP受體~[7,8]。Hippo信號通路具有高度保守性,對細胞調控的生物學功能表現(xiàn)為抑制細胞增殖、促進細胞凋亡。Hippo通路的三大組成部分包括:上游信號分子(Ex,Mer等)、核心激酶級聯(lián)反應鏈(Mst1/2、Lats1/2、Sav等)、下游效應分子(Yap/Taz)。上游分子接收并傳遞外界信號,激活核心激酶鏈的磷酸化級聯(lián)反應,引起Yap/Taz的活性改變和核/質轉位,最終激活或抑制下游靶基因的轉錄及相關蛋白表達~[9]。Hippo通路在哺乳動物中的驗證開始于小鼠肝臟。研究人員過表達小鼠肝臟細胞內(nèi)的Yap基因后發(fā)現(xiàn)細胞增殖加快,肝臟體積達到正常肝臟的3-4倍。抑制Yap的表達后,肝細胞凋亡水平升高,肝臟最終恢復至正常大小~[10]。有報道指出,Mstl/2和Savl在維持肝細胞靜態(tài)和小鼠出生后限制肝臟生長具有重要作用~[11]。另外,值得注意的是,該通路在胚胎發(fā)育過程及成體干細胞分化命運決定中也發(fā)揮了一定的調控作用~[12]。綜上所述,本文旨在進一步揭示CGRP在骨折愈合中的作用,研究CGRP對小鼠BMSCs增殖及成骨分化的影響,并對Hippo通路在這個過程中發(fā)揮的作用進行初步探討。研究方法:1、體外分離、培養(yǎng)、鑒定原代Balb/c小鼠BMSCs。2、在體外成骨誘導培養(yǎng)的BMSCs中加入不同濃度的CGRP(10~(~(-1)0)、10~(-9)、10~(-8)、10~(-7)mol/L),處理48 h后測試堿性磷酸酶(ALP)活性,篩選的優(yōu)勢濃度。3、CGRP處理BMSCs7d后進行茜素紅染色,檢測細胞的成骨分化情況。4、應用Western blot檢測CGRP作用于BMSCs后,Hippo通路核心分子Mst1/2蛋白磷酸化的表達水平。5、利用Hippo通路抑制劑維替泊芬(Verteporfin)阻斷下游Yap信號,逆轉錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)檢測其對成骨相關因子Ⅰ型膠原蛋白(collagenⅠ)、Runt相關轉錄因子2(Runx2)m RNA的表達影響。結果:1、成功分離并擴增純化Balb/c小鼠BMSCs。2、ALP活性檢測結果顯示,與空白對照組相比,10~(-9)、10~(-8)、10~(-7) mol·L~(-1)濃度范圍的CGRP都能顯著促進小鼠ALP活性的增加(P0.05),且以10~(-8) mol·L~(-1)濃度的CGRP為最佳刺激濃度。3、用10~(-8) mol·L~(-1)濃度的CGRP處理后,茜素紅染色顯示鈣化結節(jié)明顯增多。CGRP能夠顯著上調p-Mst1/2蛋白的表達(P0.05)。4、當運用了抑制劑Verteporfin時,顯著降低了CGRP誘導的Runx2、collagenⅠm RNA的表達(P0.05)。結論:1、通過貼壁篩選的手段可成功從Balb/c小鼠下肢骨骨髓中獲得所需的BMSCs。2、神經(jīng)肽CGRP能顯著地促進小鼠BMSCs增殖和成骨分化,優(yōu)勢刺激濃度為10~(-8)mol/L。3、Hippo信號通路在CGRP促進小鼠BMSCs成骨分化過程中起正向調控作用。
【關鍵詞】：降鈣素基因相關肽 骨髓間充質干細胞 Hippo信號通路 骨折愈合 增殖 分化
【學位授予單位】：第三軍醫(yī)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R683
【目錄】：

• 縮略詞表4-6
• 英文摘要6-9
• 中文摘要9-11
• 第一章 前言11-13
• 第二章 原代小鼠骨髓間充質干細胞分離、純化、鑒定13-19
• 2.1 材料與方法13-16
• 2.2 實驗結果16-18
• 2.3 討論18-19
• 第三章 降鈣素基因相關肽對小鼠骨髓間充質干細胞增殖、分化的影響19-28
• 3.1 材料與方法19-22
• 3.2 實驗結果22-27
• 3.3 討論27-28
• 第四章 Hippo通路在降鈣素基因相關肽促小鼠骨髓間充質干細胞成骨分化中的作用28-41
• 4.1 材料與方法28-36
• 4.2 實驗結果36-39
• 4.3 討論39-41
• 全文結論41-42
• 參考文獻42-44
• 文獻綜述 Hippo信號通路的研究進展44-52
• 參考文獻48-52
• 攻讀碩士期間所發(fā)表的論文52-53
• 致謝53

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1 ;Hippo signaling:A hub of growth control,tumor suppression and pluripotency maintenance[J];遺傳學報;2011年10期

2 許傳銘;萬福生;;哺乳動物Hippo信號通路:腫瘤治療的新標靶[J];遺傳;2012年03期

3 李敏睿;張盛洪;鐘碧慧;;Hippo信號通路在惡性腫瘤及干細胞中的作用[J];胃腸病學和肝病學雜志;2013年04期

4 朱忠勝;張春林;;腫瘤中Hippo-TAZ信號轉導通路研究進展[J];國際骨科學雜志;2013年03期

5 史夢婕;邵松軍;李潔媚;周艷芳;黃培春;;Hippo通路與腫瘤相關性研究進展[J];中國細胞生物學學報;2014年03期

6 李桂蘭;張麗;閆華超;;Hippo信號通路與腫瘤發(fā)生相關性研究進展[J];基礎醫(yī)學與臨床;2010年09期

7 鮑乾坤;何金龍;朱毅;;Hippo-YAP通路在心血管系統(tǒng)中的作用[J];生理科學進展;2014年03期

8 Jiliang Zhou;;An emerging role for Hippo-YAP signaling in cardiovascular development[J];The Journal of Biomedical Research;2014年04期

9 Masato Enomoto;Tatsushi Igaki;;Deciphering tumor-suppressor signaling in flies:Genetic link between Scribble/Dlg/Lgl and the Hippo pathways[J];遺傳學報;2011年10期

10 張靖;朱金水;;Hippo-YAP信號通路與胃癌相關性研究[J];國際消化病雜志;2011年04期

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1 Zhan Yang;;MicroRNA-155 and Hippo/STK3 Form a Feedback Loop to Participate in Vascular Smooth Muscle Cell Proliferation[A];中國生物化學與分子生物學會第十一次會員代表大會暨2014年全國學術會議論文集——專題報告五[C];2014年

2 Hongtan Wu;Luyao Wei;Suyuan Ji;Fuqin Fan;Funiu Qin;Lanfen Chen;Dawang Zhou;;MST1/2-Yap signaling pathway in organ size control and cancer development[A];生命的分子機器及其調控網(wǎng)絡——2012年全國生物化學與分子生物學學術大會摘要集[C];2012年

3 Zhan Yang;Bin Zheng;Yu Zhang;Xin-hua Zhang;Ming He;Dong Ma;Jin-kun Wen;;MicroRNA-155 and Hippo/STK3 Form a Feedback Loop to Participate in Vascular Smooth Muscle Cell Proliferation[A];第十二屆全國脂質與脂蛋白學術會議論文匯編[C];2014年

中國重要報紙全文數(shù)據(jù)庫 前2條

1 記者 胡德榮;我學者發(fā)現(xiàn)原癌蛋白質YAP抑制劑[N];健康報;2014年

2 記者 徐瑞哲;人造“克星”抑制胃癌[N];解放日報;2014年

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1 安健;Nedd4-like E3泛素連接酶調控Angiomotin/p130蛋白穩(wěn)定性的分子機制研究[D];復旦大學;2011年

2 劉歡;Hippo通路效應蛋白YAP調控基因轉錄的機制與功能研究[D];浙江大學;2015年

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4 朱國華;上調miR-130b通過滅活Hippo信號通路來增強膠質瘤干細胞的表型[D];新疆醫(yī)科大學;2015年

5 韓笑;Hippo信號通路中TEAD蛋白質的結構與功能研究[D];吉林大學;2016年

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9 李佳;Hippo信號通路在調節(jié)卵巢生殖干細胞功能和延緩卵巢衰老中的作用[D];南昌大學;2016年

10 劉乃華;磷酸二酯酶5/PKG通過Hippo/TAZ信號調控前列腺癌腫瘤干細胞干性及其分子機制研究[D];浙江大學;2016年

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1 王小燕;Alcf八個氨基酸差異選擇性剪接對核定位功能的影響及其抗體制備[D];重慶醫(yī)科大學;2015年

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8 武亞楠;Hippo/TAZ信號通路在骨肉瘤耐藥過程中的機制研究[D];中國人民解放軍醫(yī)學院;2016年

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本文編號：871120