發(fā)布時(shí)間：2017-09-16 19:03

  本文關(guān)鍵詞：絲素蛋白骨科內(nèi)固定材料研究

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【摘要】：研究背景對(duì)于骨折的治療,經(jīng)歷了由堅(jiān)強(qiáng)固定到生物學(xué)固定的過程。骨折治療理念的進(jìn)步對(duì)骨內(nèi)植物提出了新的要求。傳統(tǒng)的釘板系統(tǒng)存在感染、應(yīng)力遮擋、釘板移位以及主觀疼痛或感覺異常等問題。大約12%頜面部骨折患者術(shù)后需要二次手術(shù)拆除內(nèi)固定,隨著可吸收高分子聚合物材料研究的發(fā)展,如聚乙酸,聚羥基乙酸,聚乙酸乙醇酸可吸收接骨板和螺絲釘?shù)膽?yīng)用等均可降低二次手術(shù)的風(fēng)險(xiǎn),并且可以逐漸把應(yīng)力轉(zhuǎn)移到愈合的骨頭上從而促進(jìn)骨再生。這些潛在的好處說明可吸收材料在治療骨折時(shí)的樂觀前景。但這些可吸收材料也存在觸感明顯,局部自限性炎癥反應(yīng),感染和內(nèi)固定需再次拆除等問題。絲素蛋白材料是美國FDA批準(zhǔn)的,具有堅(jiān)強(qiáng)的力學(xué)性能,良好的生物相容性的可降解生物材料,可以在超過170℃環(huán)境維持結(jié)構(gòu)穩(wěn)定,可以被高溫高壓滅菌,在極端pH值下也很穩(wěn)定。根據(jù)既往文獻(xiàn)報(bào)道絲素蛋白材料具有成為制備新型的醫(yī)用可降解生物材料的良好潛能。但高強(qiáng)度的絲素蛋白材料制作過程包括各種化學(xué)試劑處理,通過溫度、濃度等實(shí)驗(yàn)條件改變誘導(dǎo)絲素蛋白內(nèi)部分子結(jié)構(gòu)的排布,如從無規(guī)蜷曲轉(zhuǎn)變?yōu)棣抡郫B結(jié)構(gòu)等,從而提高材料的強(qiáng)度,材料加工過程中不可避免的會(huì)加入有害化學(xué)試劑如甲醇,六氟異丙醇等,因此加工工藝是否會(huì)導(dǎo)致有害物質(zhì)殘留,相關(guān)物理化學(xué)性能改變而影響其良好的生物相容性和力學(xué)性能仍需要進(jìn)一步研究。研究目的本研究以制備高強(qiáng)度、可吸收且具有良好生物相容性的絲素骨科內(nèi)固定材料為目的,在文獻(xiàn)學(xué)習(xí)的基礎(chǔ)上摸索改進(jìn)材料制備條件和工藝,詳細(xì)探討了新制備材料的基本性質(zhì),并從體外細(xì)胞形態(tài)觀察,細(xì)胞毒性,細(xì)胞增殖,細(xì)胞凋亡,血液相容性等角度初步評(píng)價(jià)了絲素骨科內(nèi)固定材料的體外生物相容性,為后期動(dòng)物實(shí)驗(yàn)及臨床應(yīng)用提供依據(jù)。研究方法1.材料的制備：主要包括蠶絲脫膠、洗滌、干燥、蠶絲溶解、絲素混合溶液透析、溶液離心、冷凍凍干、再次溶解真空干燥的絲素纖維。絲素螺釘模具制作、甲醇置換、梯度換水、干燥、后期加工絲素螺釘及絲素固定板。2.材料的基本性質(zhì)：通過生物力學(xué)機(jī)器測(cè)定三點(diǎn)彎,剪切力及彈性模量數(shù)據(jù)；通過接觸角測(cè)量?jī)x測(cè)定材料表面接觸角；通過掃描電鏡觀察材料表面及橫斷面的微觀結(jié)構(gòu),并用X線衍射儀及能譜分析儀檢測(cè)材料表面的主要成分及元素組成；通過pHS-2C數(shù)字式酸度計(jì)測(cè)定浸提液的pH值；通過計(jì)算平衡鹽溶液浸泡前后絲素蛋白骨科內(nèi)固定材料重量的改變,材料直徑的變化評(píng)價(jià)吸水膨脹性能；通過計(jì)算體外蛋白酶ⅪⅤ處理下不同時(shí)間點(diǎn)材料重量改變?cè)u(píng)價(jià)降解性能；通過螺釘植入家兔股骨中評(píng)價(jià)絲素蛋白骨科內(nèi)固定材料術(shù)中的可植入性能。3.生物相容性試驗(yàn)：按照ISO 10993.12標(biāo)準(zhǔn)制備材料浸提液并培養(yǎng)細(xì)胞小鼠前成骨細(xì)胞,空白對(duì)照組采用含10%FBS的α-MEM培養(yǎng)基培養(yǎng)。采用鈣黃綠素死活細(xì)胞染色、細(xì)胞培養(yǎng)液中乳酸脫氫酶(LDH)含量測(cè)定判斷有無細(xì)胞毒性,倒置顯微鏡觀察與材料共培養(yǎng)(或者與材料浸提液共培養(yǎng))的細(xì)胞形態(tài),CCK-8法檢測(cè)材料及其浸提液對(duì)細(xì)胞相對(duì)增殖率的影響,細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)材料對(duì)細(xì)胞凋亡和壞死過程的影響,溶血試驗(yàn)判斷材料對(duì)血液紅細(xì)胞有無溶血反應(yīng),根據(jù)上述結(jié)果綜合評(píng)價(jià)絲素蛋白骨科內(nèi)固定材料的生物安全性。研究結(jié)果1.材料的表征1.1 通過生物力學(xué)機(jī)器測(cè)定絲素圓柱棒最大剪切應(yīng)力為42.6±13.5MPa。其抗彎強(qiáng)度達(dá)67.2±8.4MPa,彈性模量為8.1±1.1 GPa；與金屬材料相比其彈性模量更接近骨骼本身的彈性模量；通過植入家兔股骨試驗(yàn),共在12只家兔體內(nèi)植入24枚螺釘,均成功植入,后期觀察除了其中一只家兔右后腿跛行外,其余家兔行走均良好。前三個(gè)月標(biāo)本取出后可見螺釘仍牢固固定在股骨干內(nèi),未發(fā)生脫出或移位等情況,材料與骨質(zhì)接觸表面良好,未見顏色改變等不良反應(yīng)。1.2通過接觸角測(cè)量?jī)x測(cè)定材料表面接觸角為95.8±8.5°,提示材料表面疏水。1.3電子掃描電鏡觀察材料表面均勻,結(jié)構(gòu)致密。能譜分析儀結(jié)果提示該材料主要由碳、氮、氧、鈣組成,其中碳元素原子百分比約為62.81%,氮元素約占14.69%,氧元素約占22.40%,鈣元素約占0.1%。1.4絲素蛋白骨科內(nèi)固定材料吸水膨脹性能：浸泡10min時(shí)材料重量已經(jīng)開始增加,并且在2h開始,吸水速度開始增快,并且最終在PBS中浸泡48h后基本達(dá)到飽和,其最大吸水率達(dá)30.7±0.3%,后期隨著浸泡時(shí)間延長(zhǎng),吸水率未發(fā)生明顯改變。材料吸水后直徑也隨著浸泡時(shí)間延長(zhǎng)而不斷增加,其中直徑增長(zhǎng)速度也是在浸泡2h后開始增加,并在浸泡48h時(shí)間點(diǎn)附近直徑增大最高達(dá)17.9±1.5%。1.5體外蛋白酶XIV降解試驗(yàn)提示材料的降解曲線擬合符合二階函數(shù)規(guī)律,y=0.00087x2+0.2003x-0.495, R2=0.98,根據(jù)公式可以推導(dǎo)材料可在體外酶環(huán)境下降解3個(gè)月重量減少百分比為24.57%,體外完全降解需要8個(gè)月時(shí)間。1.6通過pHS-2C數(shù)字式酸度計(jì)測(cè)定浸提液的pH值可得到隨著浸泡時(shí)間的延長(zhǎng),其PH值未發(fā)生明顯波動(dòng)趨勢(shì),最終穩(wěn)定在7.0-7.2之間。2.材料的生物相容性2.1 細(xì)胞毒性試驗(yàn)：絲素蛋白骨科內(nèi)固定材料浸提液與MC3T3-E1細(xì)胞復(fù)合培養(yǎng)24h后,LDH活性測(cè)定,材料浸提液組與空白對(duì)照組分別為(963.0±90.0)U/L,(882.4±106.0)U/L,兩組數(shù)據(jù)之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)；鈣黃綠素死活細(xì)胞染色實(shí)驗(yàn)(綠染為活細(xì)胞,紅染為死細(xì)胞)可見絲素蛋白骨科內(nèi)固定材料周邊細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好,細(xì)胞形體正常,鋪展良好,高倍鏡下可見細(xì)胞伸展性良好,未見明顯死細(xì)胞。以上結(jié)果提示材料無明顯細(xì)胞毒性。2.2 形態(tài)觀察：絲素蛋白骨科內(nèi)固定材料及其浸提液分別與MC3T3-E1細(xì)胞復(fù)合培養(yǎng)48h后,倒置熒光顯微鏡下觀察材料及其浸提液培養(yǎng)的細(xì)胞貼壁良好,呈正常生長(zhǎng),形態(tài)呈梭形,胞漿內(nèi)可見少量離散的黑色顆粒,未見明顯細(xì)胞溶解等,符合0級(jí)標(biāo)準(zhǔn)。2.3 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)：細(xì)胞與材料共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中,隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng),各組OD值逐漸升高,雖然不同時(shí)間點(diǎn)材料共培養(yǎng)組的OD值均低于空白對(duì)照組,且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)；而在細(xì)胞與材料浸提液共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中,隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng),各組0D值逐漸升高,但實(shí)驗(yàn)組與空白對(duì)照組的OD值基本相等,未見統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)；2.4 細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)：絲素蛋白組壞死率為3.0%,凋亡率為2.3%；空白對(duì)照組壞死率為2.0%,凋亡率為2.9%；陽性對(duì)照組壞死率為3.5%,凋亡率為6.4%。材料共培養(yǎng)組與空白對(duì)照組的細(xì)胞凋亡率和壞死率沒有顯著性差異。說明絲素蛋白骨科內(nèi)固定材料不會(huì)導(dǎo)致小鼠成骨細(xì)胞的凋亡或壞死。2.5 溶血實(shí)驗(yàn)檢測(cè)絲素蛋白骨科內(nèi)固定材料的溶血率為1.9%,其溶血率符合可植入醫(yī)用材料的安全標(biāo)準(zhǔn)(5%)。結(jié)論1.本課題制備的絲素骨科內(nèi)固定材料具有良好的生物力學(xué)強(qiáng)度,且與臨床應(yīng)用廣泛的金屬材料對(duì)比其彈性模量更接近骨骼本身的彈性模量,是一種新型的高強(qiáng)度可吸收生物材料,具有較大的臨床應(yīng)用價(jià)值。2.本課題制備的絲素骨科內(nèi)固定材料吸水速率較慢,可滿足臨床醫(yī)生術(shù)中操作要求；降解周期長(zhǎng),具有為骨折愈合提供良好固定的潛力。3.本課題制備的絲素骨科內(nèi)固定材料表面具有疏水性,不利于細(xì)胞粘附；但材料周邊細(xì)胞生長(zhǎng)正常,與材料或其浸提液共培養(yǎng)均未見明顯細(xì)胞毒性,材料不影響細(xì)胞增殖,對(duì)細(xì)胞凋亡未見明顯不良影響。4.本課題制備的絲素骨科內(nèi)固定材料溶血率低于5%,具有良好的血液相容性。因此本課題制備的絲素骨科內(nèi)固定材料是一種生物相容性好,機(jī)械強(qiáng)度高,可緩慢生物降解,且降解產(chǎn)物不會(huì)對(duì)細(xì)胞機(jī)體產(chǎn)生不利影響的生物材料,具有容易植入,塑形良好,能在骨骼中保持8周以上的特征,所有這些特性都展示出其在生物醫(yī)療器械中的應(yīng)用潛力。伴隨著以后制備工藝的改進(jìn),材料表面涂層的研究,抗菌性能的添加等進(jìn)步,絲素蛋白骨科內(nèi)固定材料有望替代現(xiàn)有的可吸收骨科內(nèi)固定材料而廣泛應(yīng)用于臨床。
【關(guān)鍵詞】：絲素蛋白 骨科內(nèi)固定 生物可降解 生物相容性 生物力學(xué)
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R318.08;R687
【目錄】：

• 摘要3-8
• ABSTRACT8-15
• 第一章 前言15-18
• 1.1 骨折治療觀念的轉(zhuǎn)變15-16
• 1.2 絲素蛋白材料的應(yīng)用現(xiàn)狀16-17
• 1.3 本研究目的和主要內(nèi)容17-18
• 第二章 絲素蛋白骨科內(nèi)固定材料的制備及生物力學(xué)18-23
• 2.1 實(shí)驗(yàn)材料18-19
• 2.2 實(shí)驗(yàn)方法19-21
• 2.3 結(jié)果與討論21-23
• 第三章 絲素蛋白骨科內(nèi)固定材料的基本性質(zhì)23-33
• 3.1 材料與方法23-25
• 3.2 結(jié)果與討論25-30
• 3.3 小結(jié)30-33
• 第四章 絲素蛋白骨科內(nèi)固定材料的生物相容性33-51
• 4.1 材料與方法33-41
• 4.2 結(jié)果與討論41-47
• 4.3 材料對(duì)溶血實(shí)驗(yàn)的影響47-48
• 4.4 小結(jié)48-51
• 第五章 結(jié)語51-53
• 5.1 全文結(jié)論51-52
• 5.2 展望52-53
• 參考文獻(xiàn)53-60
• 攻讀碩士學(xué)位期間發(fā)表的論文60-61
• 致謝61-63

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本文編號(hào)：864854