本文關(guān)鍵詞：低氧條件下BNIP3對(duì)表皮細(xì)胞遷移的影響及其機(jī)制研究

  更多相關(guān)文章： 創(chuàng)面愈合 低氧 BNIP3 FAK 表皮細(xì)胞遷移 自噬

【摘要】：研究背景創(chuàng)面愈合是在多種組織和細(xì)胞協(xié)同作用下共同完成的精密調(diào)控的過程。再上皮化是創(chuàng)面愈合進(jìn)程中早期啟動(dòng)的生物學(xué)事件,在重建皮膚機(jī)械屏障的完整性中發(fā)揮重要作用,而表皮細(xì)胞遷移是貫穿于這一過程的關(guān)鍵步驟,已成為創(chuàng)面愈合研究的焦點(diǎn)。但低氧微環(huán)境對(duì)創(chuàng)面愈合過程中皮膚表皮細(xì)胞遷移是否具有調(diào)控作用及其分子調(diào)控機(jī)制,迄今均未完全闡明。BNIP3(Bcl-2 nineteen-kilodalton interacting protein 3)是僅含有非典型BH3結(jié)構(gòu)域的Bcl-2蛋白質(zhì)家族的成員之一,是一種低氧反應(yīng)蛋白。大量文獻(xiàn)證實(shí)BNIP3參與細(xì)胞增殖、凋亡、自噬、分化等生物學(xué)行為的調(diào)節(jié),并且在腫瘤的發(fā)生發(fā)展,心肌肥大與萎縮,腦缺血缺氧損害等多種疾病過程中發(fā)揮重要作用。BNIP3分布在人表皮細(xì)胞中,并參與調(diào)控其分化并維持其自穩(wěn)態(tài)。但BNIP3對(duì)表皮細(xì)胞遷移是否具有調(diào)控作用,目前尚無相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道。創(chuàng)面形成后,多種信號(hào)通路激活并動(dòng)員創(chuàng)面修復(fù)細(xì)胞,加速創(chuàng)面再上皮化進(jìn)程。黏著斑激酶(FAK)是分布于細(xì)胞質(zhì)中的一種酪氨酸蛋白激酶,在整合素家族調(diào)控細(xì)胞運(yùn)動(dòng)中發(fā)揮核心作用,主要通過397號(hào)位點(diǎn)的酪氨酸自磷酸化而激活。大量文獻(xiàn)資料表明FAK參與創(chuàng)面愈合過程中表皮細(xì)胞遷移的調(diào)控。特異性的整合素單克隆抗體的應(yīng)用可下調(diào)FAK的活化水平并抑制表皮細(xì)胞遷移;FAK缺失的小鼠創(chuàng)面愈合明顯延遲,這與FAK的活化受阻密切相關(guān)。在多種腫瘤中,FAK信號(hào)轉(zhuǎn)到途徑及其下游信號(hào)參與調(diào)節(jié)肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架的聚合、解聚及重排等細(xì)胞遷移相關(guān)的關(guān)鍵環(huán)節(jié),而BNIP3可以調(diào)節(jié)細(xì)胞肌動(dòng)蛋白骨架的重構(gòu)。因此我們推測(cè),FAK可能參與了BNIP3對(duì)表皮細(xì)胞遷移的調(diào)控。在多種哺乳動(dòng)物細(xì)胞的研究中發(fā)現(xiàn)BNIP3可通過其BH3結(jié)構(gòu)域競(jìng)爭(zhēng)Bcl-2與Beclin-1的結(jié)合位點(diǎn)破壞Bcl-2/Beclin-1的穩(wěn)定結(jié)合,從而啟動(dòng)自噬(Autophagy)。自噬是真核細(xì)胞中高度保守的一種溶酶體降解途徑,在維持機(jī)體的穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮重要作用。功能學(xué)上,自噬參與調(diào)控多種生理及病理過程,如生長(zhǎng)發(fā)育、炎癥反應(yīng)、腫瘤的發(fā)生與侵襲轉(zhuǎn)移等。近年來,表皮細(xì)胞自噬的生物學(xué)意義也受到了廣泛關(guān)注。某些具有生物活性的物質(zhì)或理化因素可誘導(dǎo)表皮細(xì)胞自噬;自噬參與調(diào)控表皮細(xì)胞分化;自噬可減少紫外線照射引起的表皮細(xì)胞損傷,促進(jìn)其存活。然而,自噬對(duì)表皮細(xì)胞遷移的影響尚缺乏研究證據(jù)。因此,本研究提出低氧條件下bnip3通過調(diào)節(jié)fak或自噬進(jìn)而調(diào)控創(chuàng)面愈合過程中表皮細(xì)胞遷移的假設(shè),通過檢測(cè)低氧條件下bnip3對(duì)表皮細(xì)胞遷移的影響,并探討其對(duì)表皮細(xì)胞fak及自噬的調(diào)節(jié),從而明確bnip3調(diào)節(jié)表皮細(xì)胞遷移的作用機(jī)制。研究方法1.建立體外低氧培養(yǎng)的小鼠原代表皮細(xì)胞模型,模擬創(chuàng)面低氧微環(huán)境,觀察低氧(2%O_2:3h、6h、9h)處理前后表皮細(xì)胞運(yùn)動(dòng)性和遷移及bnip3蛋白表達(dá)的變化規(guī)律;2.通過sirna轉(zhuǎn)染技術(shù)構(gòu)建bnip3下調(diào)的小鼠原代表皮細(xì)胞模型并進(jìn)行低氧處理(2%O_2:6h),wb檢測(cè)sirna轉(zhuǎn)染的有效性;在活細(xì)胞工作站下觀察bnip3下調(diào)對(duì)表皮細(xì)胞運(yùn)動(dòng)性的影響;體外片層細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)?zāi)M創(chuàng)面愈合過程,觀察bnip3下調(diào)對(duì)表皮細(xì)胞遷移的影響,從而明確低氧條件下bnip3對(duì)表皮細(xì)胞遷移的調(diào)控作用;3.通過wb檢測(cè)低氧(2%O_2:3h、6h、9h)處理前后表皮細(xì)胞中p-fak表達(dá)及自噬的變化;并檢測(cè)低氧條件下bnip3下調(diào)對(duì)表皮細(xì)胞fak及自噬的影響;通過tae226選擇性抑制fak的活化檢測(cè)低氧條件下fak對(duì)表皮細(xì)胞運(yùn)動(dòng)性及遷移的調(diào)控;最后,在常氧條件下用雷帕霉素激活自噬,檢測(cè)自噬對(duì)表皮細(xì)胞運(yùn)動(dòng)性及遷移的影響,從而初步明確低氧條件下bnip3調(diào)控表皮細(xì)胞遷移的可能作用機(jī)理。結(jié)果1.低氧促進(jìn)小鼠原代表皮細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)性及遷移,并顯著上調(diào)bnip3的表達(dá),且隨低氧處理時(shí)間延長(zhǎng)呈上升趨勢(shì),這與表皮細(xì)胞運(yùn)動(dòng)性隨低氧處理時(shí)間變化的規(guī)律基本契合;2.應(yīng)用靶向bnip3的sirna序列下調(diào)bnip3,通過單個(gè)細(xì)胞運(yùn)動(dòng)性檢測(cè)(活細(xì)胞工作站觀察)及體外細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn),我們發(fā)現(xiàn)bnip3的下調(diào)可有效地逆轉(zhuǎn)低氧對(duì)表皮細(xì)胞運(yùn)動(dòng)性及遷移的促進(jìn)作用,說明bnip3參與調(diào)控低氧促進(jìn)的表皮細(xì)胞遷移;3.低氧處理促進(jìn)fak的活化,并使自噬標(biāo)志物lc3-ii、p62顯著上調(diào);低氧條件下用sirna轉(zhuǎn)染下調(diào)bnip3可顯著抑制fak信號(hào)通路的激活,并且抑制fak的活性可逆轉(zhuǎn)低氧表皮細(xì)胞遷移的促進(jìn)作用,說明fak信號(hào)通路參與了低氧條件下BNIP3介導(dǎo)的表皮細(xì)胞遷移;低氧條件下下調(diào)BNIP3可顯著抑制LC3-II的上調(diào),說明低氧條件下BNIP3對(duì)表皮細(xì)胞自噬具有調(diào)控作用;但盡管常氧條件下雷帕霉素可顯著抑制表皮細(xì)胞遷移,雷帕霉素模擬的自噬與低氧處理誘導(dǎo)的自噬不盡相同,要明確BNIP3是否通過自噬調(diào)節(jié)表皮細(xì)胞遷移尚需要進(jìn)一步研究。結(jié)論低氧上調(diào)表皮細(xì)胞中BNIP3的表達(dá),并促進(jìn)FAK信號(hào)通路的的活化,從而促進(jìn)表皮細(xì)胞遷移;同時(shí)低氧可激活自噬,但自噬是否參與低氧條件下BNIP3對(duì)表皮細(xì)胞遷移的調(diào)控尚需進(jìn)一步研究。本研究首次明確BNIP3在創(chuàng)面再上皮化中的作用,并初步闡明其作用機(jī)制,為進(jìn)一步明確創(chuàng)面愈合規(guī)律提供新視角,并為臨床創(chuàng)面治療提供了新的可能靶點(diǎn)。
【關(guān)鍵詞】：創(chuàng)面愈合 低氧 BNIP3 FAK 表皮細(xì)胞遷移 自噬
【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R64
【目錄】：

• 縮略語(yǔ)表4-6
• 英文摘要6-10
• 中文摘要10-13
• 第一章 前言13-16
• 第二章 低氧對(duì)表皮細(xì)胞遷移及BNIP3 表達(dá)影響的研究16-28
• 2.1 材料與實(shí)驗(yàn)方法16-24
• 2.2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果24-26
• 2.3 討論26-27
• 2.4 小結(jié)27-28
• 第三章 低氧條件下BNIP3 對(duì)表皮細(xì)胞遷移調(diào)控作用的研究28-41
• 3.1 材料與方法28-36
• 3.2 結(jié)果36-39
• 3.3 討論39-40
• 3.4 小結(jié)40-41
• 第四章 低氧條件下BNIP3 調(diào)控表皮細(xì)胞遷移的機(jī)制研究41-63
• 4.1 材料與方法42-52
• 4.2 結(jié)果52-59
• 4.3 討論59-62
• 4.4 小結(jié)62-63
• 全文結(jié)論63-64
• 參考文獻(xiàn)64-71
• 文獻(xiàn)綜述 低氧對(duì)表皮細(xì)胞遷移的影響及其作用機(jī)制71-83
• 參考文獻(xiàn)78-83
• 攻讀碩士期間發(fā)表和投稿的論文83-84
• 致謝84

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本文編號(hào)：729351