本文關(guān)鍵詞：重組腺病毒介導(dǎo)HLA-G基因轉(zhuǎn)染恒河猴樹突狀細(xì)胞對(duì)T細(xì)胞增殖的作用

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【摘要】：[目的]將介導(dǎo)HLA-G基因的重組腺病毒轉(zhuǎn)染恒河猴未成熟樹突狀細(xì)胞,鑒定基因進(jìn)入細(xì)胞中并穩(wěn)定表達(dá)；探討恒河猴HLA-G重組腺病毒載體感染的恒河猴imDC對(duì)刺激T細(xì)胞增殖的作用。[方法]使用氯胺酮麻醉恒河猴,用穿刺針穿刺恒河猴髂后上嵴。待獲得新鮮的骨髓血后置入冰盒低溫保存。猴淋巴細(xì)胞分離液能夠有效分離單個(gè)核細(xì)胞與骨髓血中的其他細(xì)胞,免疫法獲得純度較高的CD34~+細(xì)胞。在體外成功獲取大量DC的關(guān)鍵則是添加兩種小劑量的細(xì)胞因子,即GM-CSF聯(lián)合IL-4。因此通過(guò)添加RPMI1640培養(yǎng)基給予細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)進(jìn)行體外培養(yǎng)的同時(shí)添加兩類細(xì)胞因子,誘導(dǎo)CD34~+細(xì)胞分化。用細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)生長(zhǎng)良好的imDC,按細(xì)胞數(shù)量接種于細(xì)胞培養(yǎng)板的不同培養(yǎng)孔中,同時(shí)根據(jù)不同MOI值分別加入腺病毒病毒液,同時(shí)添加細(xì)胞因子和培養(yǎng)基,48小時(shí)后觀察細(xì)胞綠色熒光色素蛋白的表達(dá)情況。HLA-G重組腺病毒感染imDC,成功提取蛋白后,運(yùn)用Western Blot檢測(cè)技術(shù)檢測(cè)目的蛋白表達(dá)的情況,對(duì)腺病毒感染imDC組和陰性對(duì)照組的灰度值比較分析。以刺激細(xì)胞和反應(yīng)細(xì)胞來(lái)進(jìn)行細(xì)胞混合淋巴細(xì)胞反應(yīng),根據(jù)不同的細(xì)胞組合和培養(yǎng)方式,將刺激細(xì)胞分為5組,各組分別進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)。各刺激細(xì)胞組分別依次刺激T細(xì)胞,按照不同的刺激細(xì)胞：反應(yīng)細(xì)胞比例,獲取各組的刺激指數(shù)(stimulation index, SI)。運(yùn)用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析各組刺激T細(xì)胞增殖的作用。[結(jié)果]免疫磁珠法獲得純度較高的CD34~+陽(yáng)性細(xì)胞,進(jìn)而運(yùn)用細(xì)胞因子聯(lián)合誘導(dǎo)獲得imDC。當(dāng)MOI不同的情況下,重組腺病毒介導(dǎo)HLA-G,成功轉(zhuǎn)染了生長(zhǎng)良好的imDC,載體在imDC中的穩(wěn)定表達(dá)。Western blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn),出現(xiàn)的特異性條帶與HLA-G表達(dá)的蛋白大小一致,在36kD見(jiàn)GADPH內(nèi)參蛋白表達(dá),兩組重組腺病毒感染組較陰性對(duì)照組表達(dá)水平上升85.77%和86.57%,推斷表明HLA-G基因進(jìn)入恒河猴imDC,在imDC中穩(wěn)定表達(dá)。混合淋巴細(xì)胞培養(yǎng),通過(guò)配對(duì)t檢驗(yàn)分析得出結(jié)論：重組腺病毒感染imDC處理組對(duì)刺激T細(xì)胞增殖的能力顯著降低。[結(jié)論](一)重組腺病毒介導(dǎo)HLA-G基因轉(zhuǎn)染恒河猴imDC, HLA-G在imDC中穩(wěn)定表達(dá)；(二)LPS誘導(dǎo)的炎癥條件能夠促進(jìn)imDC成熟,增強(qiáng)DC的抗原呈遞作用,促進(jìn)T細(xì)胞增殖；(三) HLA-G能夠有效抑制恒河猴T細(xì)胞的增殖,同時(shí)也能在炎癥條件下抑制T細(xì)胞增殖。
【關(guān)鍵詞】：HLA-G基因 肝移植 免疫耐受 恒河猴
【學(xué)位授予單位】：昆明醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R657.3
【目錄】：

• 縮略詞表5-7
• 中文摘要7-9
• 英文摘要9-11
• 前言11-14
• 材料與方法14-20
• 實(shí)驗(yàn)方法20-33
• 結(jié)果33-45
• 討論45-50
• 結(jié)論50-51
• 參考文獻(xiàn)51-57
• 綜述57-66
• 參考文獻(xiàn)62-66
• 攻讀學(xué)位期間獲得的學(xué)術(shù)成果66-67
• 致謝67

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