本文關(guān)鍵詞：17-β雌二醇抑制IL-1β誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞凋亡的作用機(jī)制研究

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【摘要】：目的:采用白細(xì)胞介素1β(interleukin-1βIL-1β)建立軟骨細(xì)胞凋亡模型,研究17-β雌二醇在其中的作用機(jī)制。方法:體外分離培養(yǎng)鼠關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞,倒置相差顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)變化,甲苯胺藍(lán)染色及II膠原蛋白免疫組化染色鑒定原代培養(yǎng)細(xì)胞為軟骨細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)分為對(duì)照組、IL-1β作用組、系列濃度的17-β雌二醇組(系列濃度的17-β雌二醇+50ng/mlrr IL-1β)及雌激素受體阻滯劑組(17-β雌二醇+ICI182780+50ng/mlrr IL-1β),CCK-8發(fā)測(cè)定細(xì)胞存活率,配制不同濃度17-β雌二醇,細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒8(cell counting kit 8,CCK-8)檢測(cè)不同濃度17-β雌二醇對(duì)軟骨細(xì)胞增殖的影響。Annexin V-FITC/PI熒光染色觀察各組細(xì)胞凋亡,采用RT-PCR方法檢測(cè)凋亡相關(guān)基因Bax、Bcl-2、MMP3及MMP13m RNA表達(dá)水平;Western blotting方法檢測(cè)MMP3、MMP13蛋白的表達(dá)水平結(jié)果:分離培養(yǎng)的SD大鼠軟骨細(xì)胞在倒置相差顯微鏡下觀察大多呈多角形,具有豐富的胞質(zhì),細(xì)胞核位于胞體中心,少數(shù)可有多個(gè)核仁,原代軟骨細(xì)胞培養(yǎng)10天左右達(dá)到融合狀態(tài)。正常軟骨細(xì)胞經(jīng)甲苯胺藍(lán)染色能使細(xì)胞胞漿呈藍(lán)色,細(xì)胞核呈紫藍(lán)色,大多數(shù)為圓形或橢圓形,可見(jiàn)多個(gè)核仁。CCK-8檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn):與對(duì)照組相比,IL-1β組僅有約40%的生存率,細(xì)胞明顯減少。與IL-1β組相比,17β-E2+IL-1β組細(xì)胞存活率顯著增加,并呈劑量依賴性。IL-1β組和17β-E2+IL-1β+ICI組之間細(xì)胞存活率沒(méi)有明顯變化。通過(guò)Annexin V-FITC和PI雙標(biāo)熒光染色顯示IL-1β誘導(dǎo)組軟骨細(xì)胞凋亡比例較3組不同濃度17β-E2(10-7 M,10-9M,10-11M)+IL-1β組均高。17β-E2+IL-1β+ICI組與IL-1β誘導(dǎo)組相比無(wú)顯著差別。RT-PCR方法檢測(cè)凋亡相關(guān)基因,與對(duì)照組比較,IL-1β誘導(dǎo)后,細(xì)胞Bax表達(dá)升高,Bcl-2表達(dá)降低,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。3組濃度的17β-E2均具有抑制IL-1β上調(diào)Bax表達(dá)的作用,與IL-1β組和17β-E2+IL-1β+ICI組比較差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。Western blotting檢測(cè)發(fā)現(xiàn)B組細(xì)胞的MMP3和MMP13/GAPDH的灰度值明顯大于A和C組(P0.05),并且D組的MMP3和MMP13/GAPDH的灰度值明顯大于A和C組(P0.05)。結(jié)論:(1)IL-1β能成功誘導(dǎo)關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞凋亡,可以用來(lái)模擬體內(nèi)骨關(guān)節(jié)炎軟骨損害的體外模型(2)17-β雌二醇能抑制IL-1β誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞凋亡,并且抑制效果成劑量依賴性。(3)17-β雌二醇是通過(guò)下調(diào)MMP-3、MMP-13的表達(dá)抑制IL-1β誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞凋亡。
【關(guān)鍵詞】：軟骨細(xì)胞 細(xì)胞凋亡 骨性關(guān)節(jié)炎 雌激素 白細(xì)胞介素-1β 基質(zhì)金屬蛋白酶
【學(xué)位授予單位】：南昌大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R684
【目錄】：

• 摘要3-5
• ABSTRACT5-9
• 中英文縮略詞表9-11
• 第1章 引言11-13
• 第2章 材料和方法13-25
• 2.1 實(shí)驗(yàn)材料13-17
• 2.1.1 細(xì)胞來(lái)源13
• 2.1.2 主要試劑及耗材13-14
• 2.1.3 主要儀器14
• 2.1.4 主要試劑配制14-17
• 2.2 實(shí)驗(yàn)方法17-24
• 2.2.1 器材的準(zhǔn)備17-18
• 2.2.2 軟骨細(xì)胞原代分離培養(yǎng)18
• 2.2.3 軟骨細(xì)胞傳代培養(yǎng)及鑒定18
• 2.2.4 CCK-8 法檢測(cè)細(xì)胞存活率18-19
• 2.2.5 Annexin V-FITC/PI熒光染色觀察各組細(xì)胞凋亡19
• 2.2.6 RT-PCR檢測(cè)Bax， Bcl-2 及MMP3，MMP13m RNA表達(dá)19-22
• 2.2.7 Western-blot檢測(cè)MMP3，MMP13蛋白表達(dá)22-24
• 2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理24-25
• 第3章 結(jié)果25-31
• 3.1 軟骨細(xì)胞的形態(tài)及鑒定25-26
• 3.2 CCK-8 發(fā)測(cè)定細(xì)胞存活率26-27
• 3.3 Annexin V-FITC/PI熒光染色觀察各組細(xì)胞凋亡27-29
• 3.4 RT-PCR檢測(cè)各組細(xì)胞Bax，，Bcl-2,MMP3,MMP13m RNA表達(dá)情況29-30
• 3.5 western blot檢測(cè)各組細(xì)胞MMP3,MMP13蛋白表達(dá)情況30-31
• 第4章 討論31-33
• 第5章 結(jié)論33-34
• 致謝34-35
• 參考文獻(xiàn)35-37
• 攻讀學(xué)位期間的研究成果37-38
• 綜述38-45
• 參考文獻(xiàn)43-45

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