本文關(guān)鍵詞：MANF參與缺氧預(yù)處理減輕大鼠創(chuàng)傷性顱腦損傷后內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的實(shí)驗(yàn)研究

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【摘要】：在目前常規(guī)武器戰(zhàn)爭中,參戰(zhàn)人員會身負(fù)的大量戰(zhàn)傷,顱腦損傷為戰(zhàn)爭時(shí)及戰(zhàn)后最致命性的損傷。創(chuàng)傷性顱腦損傷(TBI)后有多種繼發(fā)性損害,其中尤以細(xì)胞凋亡為特征的一些改變將會顯著影響病情的轉(zhuǎn)歸。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)/敏感蛋白MANF(mesencephalic astrocyte-derived neurotrophic factor)能夠增強(qiáng)細(xì)胞對多種不利因素如無糖狀態(tài)以及其它內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘因等的耐受性,通過調(diào)控內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激感受器的活性來改善細(xì)胞生理狀態(tài),從而減少細(xì)胞凋亡。研究MANF在創(chuàng)傷性顱腦損傷后的動態(tài)表達(dá)變化以及其干預(yù)措施也許會成為改善創(chuàng)傷性顱腦損傷預(yù)后的新的臨床切入點(diǎn)。第一部分MANF在大鼠創(chuàng)傷性顱腦損傷后皮質(zhì)表達(dá)變化的實(shí)驗(yàn)研究目的研究MANF在創(chuàng)傷性顱腦損傷大鼠腦皮質(zhì)的動態(tài)表達(dá)變化;探究MANF在顱腦損傷后細(xì)胞凋亡病理過程中的作用;方法108只Sprague-Dawley雄性大鼠,體質(zhì)量:230~280g,由安徽醫(yī)科大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心提供,按照隨機(jī)數(shù)字表法分為顱腦損傷TBI組(n=96)和對照Con組(n=12),TBI組采用Feeney’s自由落體撞擊法構(gòu)建模型,對照組不予處理。于傷后1h、3h、6h、12h、24h、3d、7d、14d八個(gè)不同時(shí)間點(diǎn)處死大鼠,選取大鼠挫傷區(qū)周圍皮質(zhì)腦組織,采用RT-q PCR、和Western blot檢測不同時(shí)間點(diǎn)選取的標(biāo)本組織中MANF m RNA及其蛋白的動態(tài)表達(dá)變化;采用免疫組化染色檢測MANF在挫傷區(qū)周圍皮層腦組織中的分布并測定其累積光密度值;結(jié)果rt-PCR結(jié)果:皮質(zhì)中MANF m RNA表達(dá)量在TBI后1h升高,6h達(dá)到高峰值,隨即開始下降,14d時(shí)表達(dá)回歸至正常水平,除14d外各時(shí)間點(diǎn)TBI組表達(dá)均高于Con組,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),MANF免疫組化染色結(jié)果提示其蛋白陽性表達(dá)呈棕褐色或棕黃色,定位在胞質(zhì),TBI后1h胞質(zhì)中即出現(xiàn)棕褐色或棕黃色顆粒,6h最明顯,之后各時(shí)間點(diǎn)胞質(zhì)顏色逐漸淡染,14d時(shí)切片與Con組無差異。Western-blot及免疫組化法檢測的MANF蛋白結(jié)果:TBI后1h開始升高,6h達(dá)到高峰值,14d時(shí)表達(dá)回歸至正常水平,除14d外各時(shí)間點(diǎn)TBI組表達(dá)均高于Con組,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);結(jié)論顱腦損傷后MANF陽性表達(dá)定位在胞質(zhì);MANF m RNA及其蛋白升高可能與細(xì)胞在顱腦損傷時(shí)激活一種內(nèi)源性神經(jīng)保護(hù)機(jī)制有關(guān),MANF可能參與減少顱腦損傷后內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激途徑介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。第二部分MANF參與缺氧預(yù)處理減輕大鼠創(chuàng)傷性顱腦損傷后內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的實(shí)驗(yàn)研究第一節(jié):缺氧預(yù)處理對大鼠創(chuàng)傷性顱腦損傷后內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的影響目的探討缺氧預(yù)處理(HPC)對創(chuàng)傷性顱腦損傷(TBI)大鼠腦皮質(zhì)促凋亡蛋白C/EBP同源蛋白(CHOP)表達(dá)、神經(jīng)元凋亡及神經(jīng)功能的影響。方法健康SD雄性大鼠48只按隨機(jī)數(shù)字表法分為HPC組(給予HPC模型制作)和未HPC組(不予HPC預(yù)處理),每組24只;然后進(jìn)一步分別按隨機(jī)數(shù)字表法分為對照組(不做任何處理)及TBI后1 d、3 d、7 d組(給予TBI模型制作,按照TBI后不同時(shí)間點(diǎn)觀察、處死并取材),每組6只。再另取SD大鼠48只,按上述方式分組,用于進(jìn)行m NSS評分及灌注后取腦用,大鼠在低壓氧倉中進(jìn)行每天3 h、連續(xù)3 d訓(xùn)練以給予HPC,采用改良的Freeny’s法制作TBI模型。對各組大鼠進(jìn)行神經(jīng)功能嚴(yán)重程度評分(m NSS),q RT-PCR及Western blotting檢測挫傷區(qū)周圍皮質(zhì)CHOP m RNA及蛋白表達(dá),TUNEL法檢測神經(jīng)元凋亡情況,統(tǒng)計(jì)學(xué)方法分析CHOP表達(dá)水平與神經(jīng)元凋亡指數(shù)的相關(guān)性。結(jié)果TBI 1 d、3 d、7 d組大鼠m NSS評分、CHOP m RNA和蛋白相對表達(dá)量、神經(jīng)細(xì)胞凋亡指數(shù)較對照組均明顯增高,并在傷后3 d時(shí)達(dá)到高峰值,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);并且,HPC組m NSS評分、CHOP m RNA和蛋白相對表達(dá)量、神經(jīng)細(xì)胞凋亡指數(shù)均顯著低于未HPC組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。HPC組和未HPC組中TBI 1 d、3 d、7 d組CHOP表達(dá)與神經(jīng)細(xì)胞凋亡指數(shù)呈正相關(guān)(Pearson系數(shù)分別為0.957、0.966)。結(jié)論HPC通過下調(diào)ERS途徑中CHOP的表達(dá)以減少神經(jīng)元凋亡,從而改善神經(jīng)功能。第二節(jié):缺氧預(yù)處理對創(chuàng)傷性顱腦損傷大鼠MANF表達(dá)的影響目的通過觀察缺氧預(yù)處理對大鼠創(chuàng)傷性顱腦損傷后挫傷區(qū)周圍MANF和CHOP的動態(tài)表達(dá)變化的影響,探究MANF參與缺氧預(yù)處理減輕大鼠顱腦損傷后內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的機(jī)制。方法108只Sprague-Dawley雄性大鼠,按照隨機(jī)數(shù)字表法分為缺氧預(yù)處理組和未進(jìn)行缺氧預(yù)處理組,每組54只,然后進(jìn)一步按隨機(jī)數(shù)字表法分為對照組及TBI后1h、3h、6h、12h、24h、3d、7d、14d組(TBI模型制作完成后于對應(yīng)的時(shí)間點(diǎn)處死大鼠),每亞組各6只。缺氧預(yù)處理組大鼠在低壓氧倉(-50k Pa)中進(jìn)行連續(xù)3天、每天持續(xù)3小時(shí)進(jìn)行造模;TBI造模方法同第一部分,HPC結(jié)束后1d行TBI打擊,造模結(jié)束后各亞組中大鼠直接處死,留取腦組織保存于液氮罐中用于行rt-PCR及Western-blot檢測。結(jié)果MANF m RNA及其蛋白在顱腦損傷后1h就開始上調(diào),傷后6h達(dá)到高峰值,之后開始下降,傷后7d時(shí)仍高于對照組,傷后14d時(shí)回歸到正常水平,相鄰亞組間比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);CHOP m RNA及其蛋白在傷后1h就開始增高,傷后3d才達(dá)高峰值,之后開始下降,到傷后7d時(shí)表達(dá)仍高于對照組,傷后14d時(shí)回歸到正常水平,相鄰亞組間比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。HPC組大鼠傷后1h-7d各時(shí)間點(diǎn)MANF m RNA及其蛋白相對表達(dá)量均高于未HPC組,HPC組大鼠傷后1h-7d各時(shí)間點(diǎn)CHOP m RNA及其蛋白相對表達(dá)量均低于未HPC組(均P0.05)。對照組間比較:Con組與HPC組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。結(jié)論缺氧預(yù)處理可使MANF表達(dá)增多,減少內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激途徑中CHOP表達(dá),減少神經(jīng)細(xì)胞凋亡。
【關(guān)鍵詞】：創(chuàng)傷性顱腦損傷 MANF 缺氧預(yù)處理 CHOP 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激
【學(xué)位授予單位】：安徽醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R651.15
【目錄】：

• 英漢縮略語名詞對照表6-7
• 中文摘要7-11
• Abstract11-16
• 前言16-18
• 第一部分MANF在大鼠創(chuàng)傷性顱腦損傷后皮質(zhì)表達(dá)變化的實(shí)驗(yàn)研究18-35
• 1.材料與方法18-29
• 2.實(shí)驗(yàn)結(jié)果29-32
• 3.討論32-34
• 4.結(jié)論34-35
• 第二部分MANF參與缺氧預(yù)處理減輕大鼠創(chuàng)傷性顱腦損傷后內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的實(shí)驗(yàn)研究35-50
• 第一節(jié)：缺氧預(yù)處理對大鼠創(chuàng)傷性顱腦損傷后內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的影響35-45
• 1.材料與方法35-40
• 2.結(jié)果40-43
• 3.討論43-45
• 第二節(jié)：缺氧預(yù)處理對創(chuàng)傷性顱腦損傷大鼠MANF表達(dá)的影響45-50
• 1.材料與方法45
• 2.結(jié)果45-47
• 3.討論47-49
• 4.結(jié)論49-50
• 全文總結(jié)50-51
• 參考文獻(xiàn)51-54
• 附錄54-55
• 致謝55-56
• 綜述56-62
• 參考文獻(xiàn)61-62

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本文編號：630945