本文關(guān)鍵詞：氯離子通道蛋白CLICs及其突變體與Sedlin相互作用的初步研究

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【摘要】：目的為了研究胞內(nèi)氯離子通道蛋白CLICs及其突變體與遲發(fā)性脊椎骨骺發(fā)育不良病蛋白Sedlin的相互作用,運(yùn)用分子克隆技術(shù)構(gòu)建下游為FLAG標(biāo)簽的CLICs及其突變體的真核表達(dá)質(zhì)粒。通過(guò)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染,免疫熒光實(shí)驗(yàn),免疫印跡和GST pulldown實(shí)驗(yàn)等研究蛋白質(zhì)的共定位及相互作用情況,探索CLIC家族的生物學(xué)功能。方法以pc DNA3-CLIC1-FLAG重組質(zhì)粒為模板,運(yùn)用分子克隆技術(shù)構(gòu)建真核表達(dá)質(zhì)粒pc DNA3-CLIC1(C24A)-FLAG、pc DNA3-CLIC1(C59A)-FLAG、pc DNA3-CLIC1(C24A-C59A)-FLAG、pc DNA3-CLIC1(△49-51)-FLAG;以CLIC2全長(zhǎng)c DNA序列為模板,構(gòu)建真核表達(dá)質(zhì)粒pc DNA3-CLIC2-FLAG、pc DNA3-CLIC2(C30A)-FLAG;以pc DNA3-CLIC3-FLAG重組質(zhì)粒為模板,構(gòu)建真核表達(dá)質(zhì)粒pc DNA3-CLIC3(C22A)-FLAG;以pc DNA3-CLIC4-FLAG重組質(zhì)粒為模板,構(gòu)建真核表達(dá)質(zhì)粒pc DNA3-CLIC4(C35A)-FLAG;以CLIC5全長(zhǎng)c DNA序列為模板,構(gòu)建真核表達(dá)質(zhì)粒pc DNA3-CLIC5(C32A)-FLAG。將真核表達(dá)質(zhì)粒單轉(zhuǎn)染入COS7細(xì)胞,觀察其細(xì)胞定位,再將CLICs及其突變體真核表達(dá)質(zhì)粒與p CDGFP-Sedlin共同轉(zhuǎn)染入COS7細(xì)胞中,用激光共聚焦熒光顯微鏡觀察兩種蛋白在細(xì)胞內(nèi)的共定位情況;將CLICs全長(zhǎng)及其突變體轉(zhuǎn)染入HEK 293T細(xì)胞中,提取細(xì)胞總蛋白,利用Western blot法檢測(cè)蛋白表達(dá)情況;p GEX-5X-3-SEDL轉(zhuǎn)化到BL21感受態(tài)細(xì)胞中,制備融合蛋白,同時(shí)分別轉(zhuǎn)染CLICs全長(zhǎng)及其突變體真核表達(dá)質(zhì)粒到HEK293T細(xì)胞中,通過(guò)GST pulldown技術(shù)檢測(cè)其在體外相互作用情況。結(jié)果酶切鑒定和測(cè)序結(jié)果表明成功構(gòu)建了實(shí)驗(yàn)相關(guān)的重組質(zhì)粒及突變體;Western blotting結(jié)果顯示CLIC1及其三個(gè)點(diǎn)突變體蛋白在HEK 293T細(xì)胞中均能表達(dá),CLIC2、CLIC3及CLIC4同樣均能表達(dá);免疫熒光實(shí)驗(yàn)表明,CLIC1主要定位在細(xì)胞核,胞質(zhì)也有表達(dá);CLIC1點(diǎn)突變體蛋白定位在胞質(zhì)中,細(xì)胞核中無(wú)分布;CLIC1缺失突變體蛋白定位在胞質(zhì)中,核有少量表達(dá);CLIC2在細(xì)胞核及胞質(zhì)均有定位;CLIC2點(diǎn)突變體蛋白定位發(fā)生明顯變化,有少量熒光且呈現(xiàn)點(diǎn)狀分布;CLIC3、CLIC4主要定位在胞質(zhì)中,細(xì)胞核有少量分布;CLIC5蛋白定位在胞質(zhì)中,細(xì)胞核中無(wú)分布;CLIC3點(diǎn)突變體蛋白定位在胞質(zhì)中,核有少量表達(dá);CLIC4點(diǎn)突變體蛋白定位在胞質(zhì)中,細(xì)胞核有少量分布;CLIC5點(diǎn)突變體蛋白主要定位在胞質(zhì)中,細(xì)胞核無(wú)分布;CLIC1、CLIC2與Sedlin蛋白在胞質(zhì)、胞核均有共定位;CLIC1點(diǎn)突變體與Sedlin蛋白只在胞質(zhì)存在共定位;CLIC2點(diǎn)突變體與Sedlin蛋白不存在共定位;CLIC3與Sedlin蛋白在胞質(zhì)存在共定位;CLIC3點(diǎn)突變體與Sedlin蛋白在胞質(zhì)存在共定位。GST pulldown實(shí)驗(yàn)表明野生型CLICs蛋白都和Sedlin蛋白存在相互作用,證明CLIC1點(diǎn)突變體與GST-Sedlin蛋白之間沒(méi)有互作關(guān)系。結(jié)論CLIC1及其點(diǎn)突變體、CLIC2、CLIC3及其點(diǎn)突變體與Sedlin蛋白均存在共定位;CLIC1及其三種點(diǎn)突變體,CLIC(2-4)均能在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中有效表達(dá)并且野生型CLIC(1-5)都和Sedlin蛋白存在相互作用,但CLIC1點(diǎn)突變體與后者不存在相互作用,為進(jìn)一步揭示CLICs蛋白的功能奠定了基礎(chǔ),對(duì)CLIC家族有了初步認(rèn)識(shí)。
【關(guān)鍵詞】：CLICs 免疫熒光 Western blotting 免疫共沉淀 相互作用
【學(xué)位授予單位】：安徽醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R681.1;Q78
【目錄】：

• 英文縮寫詞一覽表5-7
• 中文摘要7-9
• 英文摘要9-11
• 1 前言11-13
• 2 材料與方法13-37
• 3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果37-52
• 4 討論52-54
• 5 結(jié)論54-55
• 6 對(duì)本課題的展望55-56
• 7 參考文獻(xiàn)56-60
• 附錄60-61
• 致謝61-62
• 綜述62-74
• 參考文獻(xiàn)70-74

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前2條

1 馮瑩穎;張強(qiáng);周青春;羅勤;張曉莉;秦龍娟;;一步法定點(diǎn)突變技術(shù)快速構(gòu)建bsh基因突變啟動(dòng)子[J];生物技術(shù);2009年05期

2 宋波,唐建武,王波,崔曉楠,周春輝,侯力;基因芯片篩選小鼠肝癌淋巴道轉(zhuǎn)移相關(guān)基因[J];癌癥;2005年07期

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本文編號(hào)：579836