發(fā)布時間：2017-07-27 05:01

  本文關鍵詞：氯離子通道蛋白CLICs及其突變體與Sedlin相互作用的初步研究

  更多相關文章： CLICs 免疫熒光 Western blotting 免疫共沉淀 相互作用

【摘要】：目的為了研究胞內氯離子通道蛋白CLICs及其突變體與遲發(fā)性脊椎骨骺發(fā)育不良病蛋白Sedlin的相互作用,運用分子克隆技術構建下游為FLAG標簽的CLICs及其突變體的真核表達質粒。通過瞬時轉染,免疫熒光實驗,免疫印跡和GST pulldown實驗等研究蛋白質的共定位及相互作用情況,探索CLIC家族的生物學功能。方法以pc DNA3-CLIC1-FLAG重組質粒為模板,運用分子克隆技術構建真核表達質粒pc DNA3-CLIC1(C24A)-FLAG、pc DNA3-CLIC1(C59A)-FLAG、pc DNA3-CLIC1(C24A-C59A)-FLAG、pc DNA3-CLIC1(△49-51)-FLAG;以CLIC2全長c DNA序列為模板,構建真核表達質粒pc DNA3-CLIC2-FLAG、pc DNA3-CLIC2(C30A)-FLAG;以pc DNA3-CLIC3-FLAG重組質粒為模板,構建真核表達質粒pc DNA3-CLIC3(C22A)-FLAG;以pc DNA3-CLIC4-FLAG重組質粒為模板,構建真核表達質粒pc DNA3-CLIC4(C35A)-FLAG;以CLIC5全長c DNA序列為模板,構建真核表達質粒pc DNA3-CLIC5(C32A)-FLAG。將真核表達質粒單轉染入COS7細胞,觀察其細胞定位,再將CLICs及其突變體真核表達質粒與p CDGFP-Sedlin共同轉染入COS7細胞中,用激光共聚焦熒光顯微鏡觀察兩種蛋白在細胞內的共定位情況;將CLICs全長及其突變體轉染入HEK 293T細胞中,提取細胞總蛋白,利用Western blot法檢測蛋白表達情況;p GEX-5X-3-SEDL轉化到BL21感受態(tài)細胞中,制備融合蛋白,同時分別轉染CLICs全長及其突變體真核表達質粒到HEK293T細胞中,通過GST pulldown技術檢測其在體外相互作用情況。結果酶切鑒定和測序結果表明成功構建了實驗相關的重組質粒及突變體;Western blotting結果顯示CLIC1及其三個點突變體蛋白在HEK 293T細胞中均能表達,CLIC2、CLIC3及CLIC4同樣均能表達;免疫熒光實驗表明,CLIC1主要定位在細胞核,胞質也有表達;CLIC1點突變體蛋白定位在胞質中,細胞核中無分布;CLIC1缺失突變體蛋白定位在胞質中,核有少量表達;CLIC2在細胞核及胞質均有定位;CLIC2點突變體蛋白定位發(fā)生明顯變化,有少量熒光且呈現點狀分布;CLIC3、CLIC4主要定位在胞質中,細胞核有少量分布;CLIC5蛋白定位在胞質中,細胞核中無分布;CLIC3點突變體蛋白定位在胞質中,核有少量表達;CLIC4點突變體蛋白定位在胞質中,細胞核有少量分布;CLIC5點突變體蛋白主要定位在胞質中,細胞核無分布;CLIC1、CLIC2與Sedlin蛋白在胞質、胞核均有共定位;CLIC1點突變體與Sedlin蛋白只在胞質存在共定位;CLIC2點突變體與Sedlin蛋白不存在共定位;CLIC3與Sedlin蛋白在胞質存在共定位;CLIC3點突變體與Sedlin蛋白在胞質存在共定位。GST pulldown實驗表明野生型CLICs蛋白都和Sedlin蛋白存在相互作用,證明CLIC1點突變體與GST-Sedlin蛋白之間沒有互作關系。結論CLIC1及其點突變體、CLIC2、CLIC3及其點突變體與Sedlin蛋白均存在共定位;CLIC1及其三種點突變體,CLIC(2-4)均能在哺乳動物細胞中有效表達并且野生型CLIC(1-5)都和Sedlin蛋白存在相互作用,但CLIC1點突變體與后者不存在相互作用,為進一步揭示CLICs蛋白的功能奠定了基礎,對CLIC家族有了初步認識。
【關鍵詞】：CLICs 免疫熒光 Western blotting 免疫共沉淀 相互作用
【學位授予單位】：安徽醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R681.1;Q78
【目錄】：

• 英文縮寫詞一覽表5-7
• 中文摘要7-9
• 英文摘要9-11
• 1 前言11-13
• 2 材料與方法13-37
• 3 實驗結果37-52
• 4 討論52-54
• 5 結論54-55
• 6 對本課題的展望55-56
• 7 參考文獻56-60
• 附錄60-61
• 致謝61-62
• 綜述62-74
• 參考文獻70-74

【參考文獻】

中國期刊全文數據庫 前2條

1 馮瑩穎;張強;周青春;羅勤;張曉莉;秦龍娟;;一步法定點突變技術快速構建bsh基因突變啟動子[J];生物技術;2009年05期

2 宋波,唐建武,王波,崔曉楠,周春輝,侯力;基因芯片篩選小鼠肝癌淋巴道轉移相關基因[J];癌癥;2005年07期

，

本文編號：579836