本文關(guān)鍵詞：雌激素對角質(zhì)形成細(xì)胞增殖的影響及其機制研究

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【摘要】：研究背景和目的創(chuàng)面愈合是燒傷救治的關(guān)鍵問題,為了縮短創(chuàng)面的自然愈合時間,改善創(chuàng)面的愈合質(zhì)量,除現(xiàn)有的藥物治療和外科手術(shù)等修復(fù)創(chuàng)面方法外,尋找更好的治療藥物或其他手段以達到創(chuàng)面的高質(zhì)量愈合,一直都是臨床醫(yī)師特別是燒傷科醫(yī)師的追求目標(biāo)和科研攻關(guān)方向。以往研究表明,雌激素可對創(chuàng)面愈合的很多關(guān)鍵細(xì)胞起作用,其中就包括雌激素可以促進角質(zhì)形成細(xì)胞增殖,但目前關(guān)于雌激素影響角質(zhì)形成細(xì)胞增殖的下游分子機制尚不完全清楚,有必要進一步研究雌激素促進角質(zhì)形成細(xì)胞增殖的具體信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,從而在細(xì)胞分子層面闡明雌激素加快創(chuàng)面愈合的機制,為臨床應(yīng)用雌激素治療創(chuàng)面提供了更進一步的理論基礎(chǔ),同時也為未來更深入的研究雌激素提供了新的研究思路和方向。為此,本研究主要目的是通過觀察雌激素缺乏時對小鼠表皮發(fā)育和創(chuàng)面愈合的影響和雌激素對人永生化角質(zhì)形成細(xì)胞系(Ha Ca T)增殖的影響,從而探索雌激素促進角質(zhì)形成細(xì)胞增殖的分子機制。研究方法(1)將通過陰道脫落細(xì)胞學(xué)檢查法選取的5只處于動情期的C57BL/6成年(8周齡大小)小鼠設(shè)為動情期組,將5只性發(fā)育前(4周齡大小)行卵巢切除的成年(8周齡大小)C57BL/6小鼠設(shè)為卵巢切除組。取2組小鼠尾根部1 cm寬的全層皮膚,免疫組織化學(xué)法觀察表皮增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)陽性細(xì)胞分布并計數(shù),HE染色觀察并測量表皮厚度。(2)將通過陰道脫落細(xì)胞學(xué)檢查法選取的5只處于動情期的C57BL/6成年(8周齡大小)小鼠設(shè)為動情期組,將5只性發(fā)育前(4周齡大小)行卵巢切除的C57BL/6成年(8周齡大小)小鼠設(shè)為卵巢切除組。在2組小鼠背部脊柱兩側(cè)制作長度為1 cm的全層皮膚切口,并在傷后的0、1、3、5、7天拍照觀測創(chuàng)面愈合率,然后在傷后第7天取小鼠創(chuàng)周皮膚組織,通過HE染色觀測2組小鼠創(chuàng)面新生上皮長度。(3)通過陰道脫落細(xì)胞學(xué)檢查法將16只C57BL/6成年(8周齡大小)小鼠分為動情前期組、動情期組、動情后期組、動情間期組,每組4只。將4只性發(fā)育前(4周齡大小)行卵巢切除的成年(8周齡大小)C57BL/6小鼠設(shè)為卵巢切除組。采集5*本課題受創(chuàng)傷燒傷復(fù)合傷國家重點實驗室項目(No.SKLZZ201230);國家自然科學(xué)基金項目(No.81201464);國家衛(wèi)生部衛(wèi)生行業(yè)專項計劃(No.201202002);和中國人民解放軍科學(xué)研究基金項目(No.BWS11J0390)資助。組小鼠腹部正常皮膚組織,用蛋白質(zhì)免疫印跡法檢測p-erk、p-akt、pcna蛋白表達水平。(4)取處于對數(shù)生長期hacat細(xì)胞,用含體積分?jǐn)?shù)10%fbs的rpmi1640培養(yǎng)液培養(yǎng)(下同),按隨機數(shù)字表法分為陰性對照組、單純雌二醇組、蛋白激酶b(akt)抑制劑組、細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶(erk)抑制劑組,每組含25個孔。各組培養(yǎng)液中,陰性對照組加入1μl二甲基亞砜;單純雌二醇組加入100nmol/l17β-雌二醇1μl;akt抑制劑組和erk抑制劑組均加入同前劑量與體積17β-雌二醇,另分別加入10μmol/lly294002和30μmol/lpd98059各1μl。分別于培養(yǎng)0(即刻)、24、48、72、96h,每組取5孔細(xì)胞,用細(xì)胞計數(shù)試劑盒與酶標(biāo)儀檢測細(xì)胞增殖水平(結(jié)果以吸光度值表示)。(5)另取處于對數(shù)生長期hacat細(xì)胞,同前(4)實驗分組和處理細(xì)胞,每組含3個孔。培養(yǎng)72h,用流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期分布,并以此按公式計算出各組細(xì)胞的增殖指數(shù)(pi,proliferationindex)和s期比例(spf,sphasefraction)。(6)另取處于對數(shù)生長期hacat細(xì)胞,按雌激素(17β-雌二醇)處理時間不同分為7個組,即0min組(未經(jīng)雌激素處理)、5min組、15min組、30min組、60min組、120min組、240min組。在相應(yīng)培養(yǎng)時間收集各組細(xì)胞并提取蛋白,然后用蛋白質(zhì)免疫印跡法檢測各組細(xì)胞磷酸化erk(p-erk)、磷酸化akt(p-akt)和增殖細(xì)胞核抗原(pcna)蛋白水平。(7)另取處于對數(shù)生長期hacat細(xì)胞,同前(4)實驗分組和處理細(xì)胞,每組含3個孔。培養(yǎng)72h,收集各組細(xì)胞并提取蛋白,然后用蛋白質(zhì)免疫印跡法檢測各組細(xì)胞磷酸化erk(p-erk)、磷酸化akt(p-akt)和增殖細(xì)胞核抗原(pcna)蛋白水平。(8)另取處于對數(shù)生長期hacat細(xì)胞,同前(4)實驗分組和處理細(xì)胞,每組含3個孔。培養(yǎng)72h,收集各組細(xì)胞并提取總rna,然后用實時熒光定量pcr法檢測各組細(xì)胞糖原合成激酶3β(glycogensynthasekinase3β,gsk-3β)基因和哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammaliantargetofrapamycin,mtor)基因的表達水平。(9)統(tǒng)計分析:對數(shù)據(jù)行t檢驗、單因素方差分析、析因設(shè)計方差分析、lsd檢驗。研究結(jié)果(1)2組小鼠表皮pcna陽性細(xì)胞主要集中于表皮基底層;卵巢切除組小鼠表皮中pcna陽性細(xì)胞數(shù)為(37?12)個,明顯少于動情期組的(96?15)個(t=15.3,p0.01)。卵巢切除組小鼠表皮厚度為(33.5?3.0)μm,明顯低于動情期組的(51.4?3.1)μm(t=20.7,p0.01)。(2)在傷后第5天,與動情期組小鼠創(chuàng)面愈合率(59.0?2.2)%相比,卵巢切除組小鼠創(chuàng)面愈合率(49.9?2.1)%降低(p0.05),在傷后第7天,與動情期組小鼠創(chuàng)面愈合率(85.5?3.0)%相比,卵巢切除組小鼠創(chuàng)面愈合率為(73.0?0.9)%,愈合顯著延遲(p0.01)。(3)不同動情周期的小鼠和卵巢切除小鼠正常皮膚中,p-akt、p-erk以及pcna表達水平不一致。動情前期和動情期小鼠皮膚中p-erk、p-akt、pcna蛋白的表達水平要高于動情后期、動情間期和卵巢切除組小鼠。(4)培養(yǎng)0~48h,單純雌二醇組與陰性對照組細(xì)胞增殖水平差異不明顯(p值均大于0.05)。培養(yǎng)72h,與陰性對照組的0.983?0.060比較,單純雌二醇組細(xì)胞增殖水平明顯增高(2.092?0.177,p0.01);akt抑制劑組、erk抑制劑組細(xì)胞增殖水平分別為0.325?0.031、0.359?0.063,均明顯低于前2組(p值均小于0.01)。培養(yǎng)96h,單純雌二醇組細(xì)胞增殖水平為1.888?0.022,仍高于陰性對照組的0.669?0.032(p0.01),而akt抑制劑組和erk抑制劑組增殖水平分別為0.367?0.019、0.474?0.011,均低于陰性對照組和單純雌二醇組(p值均小于0.01)。(5)培養(yǎng)72h,與陰性對照組的pi(51.6?1.1)%比較,單純雌二醇組細(xì)胞pi明顯升高[(58.5?0.8)%,p0.05];akt抑制劑組、erk抑制劑組細(xì)胞pi分別為(34.9?0.8)%、(48.2?0.4)%,均明顯低于前2組(p值小于0.01或0.05)。與陰性對照組的spf(31.7?1.2)%比較,單純雌二醇組細(xì)胞spf明顯升高[(40.2?0.5)%,p0.01];akt抑制劑組spf為(15.7?0.7)%,明顯低于前兩組(p值均小于0.01),erk抑制劑組spf為(33.0?0.1)%,與陰性對照組差異不明顯(p0.05),但仍低于單純雌二醇組(p0.01)。(6)培養(yǎng)5min后,p-erk即開始顯著的升高,5、15、30min組細(xì)胞p-erk表達水平分別為3.306?0.042、1.847?0.053、0.545?0.053,與0min組細(xì)胞p-erk表達水平0.037?0.017)相比,均有顯著性升高(p值均小于0.01),但隨后又逐漸下降,即0min組細(xì)胞與60min、120min、240min組細(xì)胞差異不明顯(p值均大于0.05)。培養(yǎng)15min后,與0min組細(xì)胞p-akt表達水平0.100?0.007相比,15、30、60、120min組細(xì)胞p-akt表達水平分別是0.153?0.007、0.188?0.009、0.201?0.007、0.220?0.006,均有顯著性升高(p0.05或p0.01),但240min組細(xì)胞p-akt表達水平與0min組細(xì)胞相比差異不明顯(p0.05)。與0min組細(xì)胞相比,在17β-雌二醇處理hacat細(xì)胞240min內(nèi),pcna表達水平一直無明顯變化(p0.05)。(7)培養(yǎng)72 h,與陰性對照組的0.566?0.034比較,單純雌二醇組細(xì)胞p-Akt蛋白水平明顯升高(1.048?0.077,P0.01);Akt抑制劑組和ERK抑制劑組細(xì)胞p-Akt蛋白水平分別為0.682?0.095、0.672?0.019,顯著低于單純雌二醇組(P值均小于0.01)。培養(yǎng)72 h,與陰性對照組的0.469?0.013比較,單純雌二醇組、Akt抑制劑組、ERK抑制劑組細(xì)胞p-ERK蛋白水平均明顯升高(分別為1.064?0.089、1.010?0.038、0.778?0.065,P值均小于0.01)。與單純雌二醇組比較,ERK抑制劑組細(xì)胞p-ERK蛋白水平明顯降低(P0.01)。培養(yǎng)72 h,與陰性對照組的0.386?0.053比較,單純雌二醇組細(xì)胞PCNA蛋白水平明顯升高(0.743?0.043,P0.01);Akt抑制劑組和ERK抑制劑組細(xì)胞PCNA蛋白水平分別為0.264?0.019、0.223?0.065,明顯低于前2組(P值均小于0.01)。(8)培養(yǎng)72 h,與陰性對照組細(xì)胞m TOR基因表達水平(1.003?0.058)相比,單純雌二醇組細(xì)胞mTOR基因表達水平明顯升高(1.803?0.292,P0.05),而Akt抑制劑組細(xì)胞(1.255?0.081)和ERK抑制劑組細(xì)胞(0.987?0.042)mTOR基因表達水平升高不明顯(P0.05)。與單純雌二醇組相比,Akt抑制劑組與之差異不明顯(P0.05),ERK抑制劑組mTOR基因表達水平明顯降低(P0.05)。與陰性對照組細(xì)胞Gsk-3β基因表達水平(1.015?0.124)相比,單純雌二醇組細(xì)胞Gsk-3β基因表達水平明顯降低(0.043?0.003,P0.01),而Akt抑制劑組細(xì)胞(0.526?0.0042)和ERK抑制劑組細(xì)胞(0.276?0.040)Gsk-3β基因表達水平也明顯降低(P值均小于0.01)。與單純雌二醇組相比,ERK抑制劑組與之差異不明顯(P0.05),Akt抑制劑組Gsk-3β基因表達水平明顯升高(P0.01)。研究結(jié)論雌激素缺乏時,小鼠表皮增殖發(fā)育能力減弱,創(chuàng)面愈合速率減慢。雌激素可通過ERK/Akt信號通路介導(dǎo)下游PCNA的表達從而調(diào)控角質(zhì)形成細(xì)胞的增殖,從增殖角度為雌激素促進皮膚創(chuàng)面再上皮化、加快創(chuàng)面愈合提供了分子機制。
【關(guān)鍵詞】：雌激素類 增殖細(xì)胞核抗原 細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶類 蛋白激酶類 HaCa T細(xì)胞
【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R641
【目錄】：

• 縮略語表4-6
• 英文摘要6-12
• 中文摘要12-16
• 1. 前言16-17
• 2. 實驗材料17-19
• 3. 實驗方法19-26
• 4. 實驗結(jié)果26-35
• 5. 討論35-38
• 全文結(jié)論38-39
• 參考文獻39-42
• 文獻綜述 雌激素促進皮膚創(chuàng)面愈合的研究進展42-53
• 參考文獻47-53
• 攻讀碩士學(xué)位期間研究成果53-54
• 致謝54

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本文編號：562110