發(fā)布時間：2017-06-28 15:07

  本文關鍵詞：依普黃酮對人骨關節(jié)炎軟骨生物學、生物力學性能作用的體外研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的:1、研究Indian hedgehog(Ihh)信號通路抑制劑—依普黃酮(ipriflavone,IP)是否可以阻止骨關節(jié)炎(osteoarthritis,OA)軟骨細胞的肥大分化及軟骨組織的降解,從而緩解OA;2、研究IP對OA軟骨細胞增殖、凋亡的影響,從而為治療OA提供實驗依據(jù);3、運用微管吸吮技術,研究Ihh(力學敏感基因)通路抑制劑—IP是否可改善OA軟骨細胞的生物力學性能。方法:1、選取因OA進行膝關節(jié)置換而截下的outbridge評分1-2分的脛骨平臺關節(jié)軟骨,消化成軟骨細胞進行細胞培養(yǎng)、切成4mm3大小進行軟骨組織塊培養(yǎng);2、采用熒光免疫的方法鑒定軟骨細胞表型,以確定所培養(yǎng)的細胞為軟骨細胞;3、軟骨細胞、軟骨組織塊實驗均分為DMSO空白組、IP低濃度組、IP高濃度組;4、于IP干預2天培養(yǎng)后細胞進行RT-q PCR,檢測SMO、Gli-1、Gli-2、Gli-3(Ihh信號通路指標)、Runx-2、MMP-13(軟骨細胞肥大指標)及COL II、Aggrecan(軟骨代謝指標);細胞進行Western Blotting,檢測COL II、MMP-13、COL X蛋白的變化;5、于IP干預2天培養(yǎng)后采用CCK-8、Ed U及流式方法檢測IP對OA軟骨細胞增殖、凋亡的影響情況;6、于IP干預2天培養(yǎng)后,細胞進行微管吸吮,觀察IP對OA軟骨細胞生物力學性能的影響。7、IP干預OA軟骨組織塊2天后石蠟切片番紅O-固綠染色,高倍鏡下觀察蛋白多糖的變化,并進行組織學Mankin評分;進行免疫熒光染色,檢測COL II、Runx-2、COL X蛋白表達的變化;結果:1、軟骨細胞表型鑒定:細胞免疫熒光染色顯示,所培養(yǎng)的軟骨細胞I型膠原(COL I)染色為陰性,II型膠原(COL II)的染色為陽性,可以確定從軟骨組織中分離的細胞為軟骨細胞;2、IP通過抑制Ihh信號通路對OA軟骨細胞的肥大分化及細胞代謝影響的RT-q PCR結果:IP藥物組Ihh信號通路指標SMO、Gli-1、Gli-2、Gli-3及軟骨細胞肥大分化指標Runx-2、MMP-13的m RNA較DMSO空白組表達水平下降(P0.05),軟骨細胞代謝指標Aggrecan(蛋白多糖)、COL II的m RNA水平較DMSO對照組顯著增高(P0.05);3、IP可以促進OA軟骨Col II蛋白表達,抑制MMP-13、COL X蛋白表達:IP干預OA軟骨細胞2天后,Western Blotting結果表明,IP藥物組OA軟骨細胞的Col II蛋白表達明顯多于DMSO對照組,MMP-13、COL X(軟骨細胞肥大分化的OA指標)表達較DMSO對照組更少,灰度值半定量結果有統(tǒng)計學意義(P0.05);4、IP對OA軟骨細胞增殖、凋亡的影響:首先用CCK-8檢測增殖情況,實驗結果發(fā)現(xiàn)細胞培養(yǎng)第3天、第4天時,IP藥物組的細胞增殖明顯高于DMSO對照組(P0.05);針對細胞第3天的增殖結果,采用Ed U染色驗證了CCK-8檢測增殖的結果;流式方法測IP對OA軟骨細胞凋亡的影響結果發(fā)現(xiàn),細胞培養(yǎng)第3天,IP藥物組的軟骨細胞凋亡率相對DMSO對照組均顯著降低(P0.05);5、微管吸吮分析IP對OA軟骨細胞生物力學特性的影響:人OA軟骨細胞表現(xiàn)為典型的黏彈性固體蠕變特征,細胞瞬時模量(E0)、平衡模量(E∞)、表觀黏性(μ)較正常軟骨細胞均升高,但用IP藥物干預后,OA軟骨細胞的E0、E∞、μ明顯降低,生物力學性能得到改善(P0.05);6、IP體外干預人OA軟骨組織塊2天后番紅O-固綠染色顯示IP對OA軟骨組織塊蛋白多糖的影響:IP藥物干預人OA軟骨組織塊后,IP藥物組軟骨組織塊相對DMSO對照組其軟骨細胞更多、蛋白多糖(PG)染色更深;組織學Mankin評分DMSO對照組、IP低濃度組、IP高濃度組3組分別為8.34±0.58,4.67±0.57(P0.01),2.34±0.28(P0.001),分數(shù)越低,OA軟骨退變越輕;7、免疫熒光染色顯示IP對OA軟骨組織塊相關蛋白表達的影響:IP體外干預人OA軟骨組織塊2天后的免疫熒光染色顯示,IP藥物組軟骨組織塊的Col II明顯多于DMSO對照組,Runx-2、COL X表達較DMSO對照組更少�？梢�,IP可以促進OA軟骨組織塊Col II表達,抑制Runx-2、COL X表達,從而緩解軟骨組織塊的降解。結論:Ihh通路抑制劑—依普黃酮(IP)在細胞水平及擬在體的組織塊水平證實可以抑制Ihh信號通路,進而阻止OA軟骨細胞的肥大分化及軟骨組織的降解,從而對OA時的軟骨具有保護作用;同時,IP也可以促進OA軟骨細胞的增殖,抑制其凋亡,改善體外培養(yǎng)OA軟骨細胞的生物力學性能,在OA治療方面具有積極意義。因此,IP可能具有治療OA的作用。
【關鍵詞】：indian hedgehog 骨關節(jié)炎 依普黃酮 細胞肥大 增殖 凋亡 生物力學
【學位授予單位】：山西醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R684.3
【目錄】：

• 中文摘要6-9
• 英文摘要9-12
• 常用縮寫詞中英文對照表12-13
• 前言13-15
• 1 材料與方法15-34
• 1.1 一般資料15-17
• 1.2 研究方法17-33
• 1.3 統(tǒng)計學處理33-34
• 2 結果34-42
• 2.1 人OA軟骨細胞的形態(tài)學觀察及表型鑒定34
• 2.2 IP對OA軟骨細胞Ihh信號通路及細胞肥大分化基因影響的RT-PCR結果34-35
• 2.3 IP可以促進OA軟骨細胞Col II蛋白表達，抑制MMP-13、COL X蛋白表達35-36
• 2.4 IP對OA軟骨細胞增殖、凋亡的影響36-37
• 2.5 微管吸吮分析IP對OA軟骨細胞力學特性的影響37-38
• 2.6 番紅O-固綠染色顯示IP對OA軟骨組織塊蛋白多糖的影響38-39
• 2.7 IP體外干預人OA軟骨組織塊2天后的免疫熒光染色39-42
• 3 討論42-46
• 3.1 Ihh通路抑制劑—IP對OA軟骨細胞肥大分化及軟骨組織降解的影響42-43
• 3.2 IP對OA軟骨細胞增殖、凋亡的影響43
• 3.3 IP對OA軟骨細胞生物力學性能的影響43-44
• 3.4 其他的Ihh信號通路抑制劑及相關治療藥物44
• 3.5 不足及展望44-46
• 4 結論46-47
• 參考文獻47-49
• 綜述49-60
• 參考文獻55-60
• 致謝60-61
• 在學期間承擔/參與的科研課題與研究成果61-63
• 個人簡歷63

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本文編號：494267