本文關鍵詞：低強度振動載荷協(xié)同多孔鈦合金對長骨骨缺損修復的作用效果及機制研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：骨缺損是矯形外科的常見病和難治病,其發(fā)病原因包括疾病、外傷和某些手術并發(fā)癥。自體骨移植對于較小的缺損區(qū)域是臨床治療的金標準,但對于大量的骨缺損病患,患者自身骨量不足,影響預后。異體骨移植有較大的抗原反應和感染風險。骨替代材料一直是骨移植的重要選擇。鈦合金是一種重要的骨移植替代材料。但傳統(tǒng)的鈦合金骨整合效果較差,力學屬性不理想。近年來,隨著3D打印技術的發(fā)展,多孔鈦合金(porou titanium alloy,p Ti)越來越多的被應用于臨床,為骨缺損的金屬材料修復提供了新思路。相比于傳統(tǒng)鈦合金,pTi具有與骨小梁更相近的結構特征,多孔結構本身能為骨骼中的組織液傳輸提供有效的孔隙通道。但是,由于鈦是惰性金屬,pTi只能與骨組織以機械鉚合的形式結合,而非穩(wěn)定的化學鍵結合方式,因此仍難以實現(xiàn)早期快速的骨整合,骨缺損修復的效率和質量仍受到限制。低強度全身振動載荷(Low-level whole-body vibration,WBV)是一種安全、經濟、非侵入的物理因子作用方式,不同參數(shù)的WBV刺激對動物和人體骨骼具有顯著的調控作用。國內外的大量實驗研究證明,WBV能夠有效抑制由廢用和絕經導致的骨質疏松,減緩骨量流失,提高骨強度,預防骨折的發(fā)生。而一些臨床研究也證實,WBV能夠顯著提高正常人群和骨質疏松患者的全身骨量,調控機體的骨轉換。同時,諸多臨床前實驗也證實WBV能夠顯著促進骨折愈合。但是,WBV是否能夠提高pTi的骨整合及骨長入效果,進而提高骨缺損修復效率和修復質量,國內外尚未見相關的文獻報道。在本研究中,首先,我們通過體外實驗探索了wbv對于pti中的成骨細胞結構、細胞生物學行為、成骨活性以及成骨相關重要基因和蛋白表達的影響;然后,我們通過體內實驗系統(tǒng)探索wbv協(xié)同pti對于兔長骨骨缺損的修復效果及其潛在的作用機制。本研究旨在系統(tǒng)揭示wbv對于pti骨整合和骨再生的影響及其體內外作用機制,從而為骨缺損的修復提供新思路,同時還有望降低臨床骨缺損的修復治療成本,改善骨缺損病患的生活質量。本課題的研究不但具有重要的科學研究參考價值,還具有重要的臨床應用價值。整個課題主要分為以下兩個部分:實驗一:wbv對pti中的兔原代成骨細胞行為和功能的影響及機制研究方法:通過cad技術設計出多孔結構的三維模型(12mm×2.5mm圓片,孔隙率約70%,孔隙直徑約1mm),導入3d打印系統(tǒng),通過電子束熔融技術將ti-6al-4v粉末逐層熔融凝固,制成pti材料,經過超聲清洗、高溫高壓滅菌后,作為實驗用pti。提取新西蘭兔原代成骨細胞作為種子細胞,種植于pti內部,施加一定時間的wbv刺激。分別通過mtt法檢測細胞增殖,通過dapi染色和電鏡觀察細胞在pti表面的粘附情況,通過fitc染色觀察細胞骨架情況。提取總rna和總蛋白通過qrt-pcr和western-blot方法檢測成骨相關基因和蛋白的表達。結果:mtt結果顯示wbv顯著促進了成骨細胞在pti表面的增殖(p0.05);dapi染色和掃描電鏡結果顯示實驗組成骨細胞在材料表面的附著數(shù)量和細胞偽足數(shù)量都顯著多于對照組;fitc細胞骨架熒光染色結果表明實驗組pti表面粘附的細胞數(shù)量多于對照組(p0.05),實驗組細胞可伸展出更多的微絲附著于pti表面(p0.05);qrt-pcr結果顯示wbv顯著上調了成骨相關基因和經典wnt信號通路基因的表達,western-blot結果顯示wbv顯著上調了成骨相關蛋白和經典wnt信號通路蛋白的表達。結論:wbv刺激可以顯著加快pti內部成骨細胞的增殖,提高成骨細胞在pti表面的粘附效果,上調細胞內成骨相關基因和蛋白的表達。實驗二:wbv協(xié)同pti對兔長骨缺損修復的作用效果及機制研究方法:通過cad技術設計出多孔結構的三維模型(6mm×8mm圓柱體,孔隙率約70%、孔隙直徑約1mm),導入3d打印系統(tǒng),通過電子束熔融技術將ti-6al-4v粉末逐層熔融凝固,制成pti材料,經過超聲清洗、60co輻照滅菌后,作為實驗用種植體。雌性新西蘭大耳白兔24只,體重3.0±0.4kg,肌肉注射3%戊巴比妥鈉溶液(1ml/kg)和鹽酸賽拉嗪注射液(0.1ml/kg)麻醉,在左側股骨外側髁位置制作深8mm,直徑6mm圓柱形骨缺損區(qū)域,填充pTi。術后1周,將實驗動物按體重分為實驗組(pTi+WBV)和對照組(pTi),實驗組每天施加WBV(30Hz,0.5g)1h,對照組不做任何處理。分別在WBV刺激6周、12周后隨機對每組半數(shù)實驗動物取材。取材前分兩次注射8%鈣黃綠素溶液(1ml/kg)。樣本進行X線正、側位片檢查,Micro-CT檢查,熒光雙標分析,Masson染色,qRT-PCR檢測,甲苯胺藍染色。結果:X線正、側位片顯示骨缺損造模過程中pTi的種植位置正確;Micro-CT檢查結果顯示在6周、12周WBV刺激后,實驗組pTi與骨組織整合情況要優(yōu)于對照組,實驗組BV/TV、Tb.N均高于對照組(P0.05),BS/BV、Tb.Sp均低于對照組(P0.05);Masson染色結果顯示實驗組骨長入情況優(yōu)于對照組;熒光雙標結果顯示,實驗組的礦化沉積率(MAR)、礦化面積比(MS/BS)和骨形成率(BFR/BS)均高于對照組;qRT-PCR結果顯示,經過6周、12周WBV刺激,實驗組成骨相關基因ALP、OCN、Runx2、BMP2、OPG表達均顯著高于對照組(P0.05),Sost與RANKL基因表達均顯著低于對照組(P0.05),經典Wnt信號通路基因Wnt3a,Lrp6和β-catenin均顯著高于對照組(P0.05);甲苯胺藍染色結果顯示實驗組成骨細胞數(shù)量多于對照組。結論:WBV能夠提高pTi骨整合效果,改善pTi骨組織附著和長入。在微觀層面上改善了骨組織和植入體的整合,從而改善骨缺損的修復效果,提高了pTi的穩(wěn)定性,避免了松動和炎癥的發(fā)生。
【關鍵詞】：全身振動載荷 多孔鈦合金 成骨細胞 骨缺損
【學位授予單位】：第四軍醫(yī)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R68
【目錄】：

• 縮略語表6-8
• 中文摘要8-11
• 英文摘要11-15
• 前言15-17
• 文獻回顧17-31
• 實驗一 WBV對PTI中的兔原代成骨細胞行為和功能的影響及機制研究31-49
• 1 材料31-32
• 1.1 實驗動物31
• 1.2 實驗試劑及耗材31
• 1.3 實驗儀器31-32
• 2 方法32-40
• 2.1 兔原代成骨細胞的提取32-33
• 2.2 成骨細胞的觀察和鑒定33-34
• 2.2.1 成骨細胞的鏡下觀察33
• 2.2.2 ALP染色33
• 2.2.3 茜素紅S染色33-34
• 2.3 三維pTi圓片的制作34
• 2.4 對成骨細胞施加WBV刺激34-35
• 2.5 WBV對成骨細胞形態(tài)的影響35-36
• 2.5.1 掃描電鏡下pTi表面成骨細胞的形態(tài)35-36
• 2.5.2 免疫熒光染色觀察pTi表面細胞形態(tài)36
• 2.6 WBV對成骨細胞增殖的影響36-37
• 2.7 WBV對成骨細胞成骨相關信號通路的影響37-40
• 2.7.1 WBV對成骨相關基因的影響37-38
• 2.7.2 WBV對成骨相關蛋白的影響38-40
• 2.8 統(tǒng)計學分析40
• 3.結果40-47
• 3.1 原代成骨細胞的提取40
• 3.2 原代成骨細胞的鑒定40-41
• 3.3 pTi圓片的制作結果41-42
• 3.4 WBV的施加效果42-43
• 3.5 WBV對成骨細胞粘附影響結果43-44
• 3.6 WBV刺激對成骨細胞形態(tài)影響結果44-45
• 3.7 WBV對pTi表面細胞增殖的影響結果45
• 3.8 WBV對成骨相關信號通路的表達的影響結果45-47
• 4 討論47-49
• 實驗二 WBV協(xié)同PTI對兔長骨缺損修復的作用效果及機制研究49-64
• 1 材料49-50
• 1.1 實驗動物49
• 1.2 實驗儀器及耗材49
• 1.3 實驗試劑49-50
• 2 方法50-54
• 2.1 多孔結構pTi的制備50
• 2.2 骨缺損動物模型的制備50
• 2.3 WBV的施加及樣本處理50-52
• 2.4 取材及樣本處理52
• 2.5 Micro-CT檢查52
• 2.6 硬組織切片檢查52-53
• 2.7 Masson染色分析53
• 2.8 成骨相關基因檢查53
• 2.9 成骨細胞染色觀察53-54
• 2.10 統(tǒng)計學分析54
• 3 結果54-62
• 3.1 pTi種植體制作情況54
• 3.2 骨缺損造模結果54-55
• 3.3 樣本X線檢查結果55-56
• 3.4 Micro-CT檢查結果56-57
• 3.5 熒光雙標檢查結果57-58
• 3.6 Masson染色結果58-59
• 3.7 qRT-PCR檢查結果59-61
• 3.8 骨小梁表面成骨細胞染色結果61-62
• 4 討論62-64
• 小結64-65
• 參考文獻65-82
• 個人簡歷和研究成果82-84
• 致謝84

  本文關鍵詞：低強度振動載荷協(xié)同多孔鈦合金對長骨骨缺損修復的作用效果及機制研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：426885