發(fā)布時(shí)間：2017-05-28 01:11

  本文關(guān)鍵詞：慢病毒轉(zhuǎn)GGCX基因?qū)ν霉切躁P(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞的生物學(xué)影響，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：研究目的:通過(guò)檢測(cè)慢病毒介導(dǎo)的γ-谷氨�；然�(Vitamin K dependent gammaglutamyl carboxylase,GGCX)基因轉(zhuǎn)染兔骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞后對(duì)其凋亡的影響,以及對(duì)兔膝骨性關(guān)節(jié)炎的軟骨細(xì)胞中MMP13、Ⅱ型膠原和Ⅹ型膠原的影響,探討其對(duì)兔膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞的作用。進(jìn)而為體外骨性關(guān)節(jié)炎的基因治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。研究方法:1、選取12只重量約(2.0±0.2)kg左右的日本雄性大耳兔,運(yùn)用膝前交叉韌帶切斷的方法構(gòu)建動(dòng)物模型。對(duì)白兔進(jìn)行6周飼養(yǎng)后處死,對(duì)兔膝關(guān)節(jié)的軟骨細(xì)胞進(jìn)行分離以及培養(yǎng),最后運(yùn)用Alcian Blue染色法以及Ⅱ型膠原纖維染色法對(duì)軟骨細(xì)胞做鑒定。2、隨機(jī)將軟骨細(xì)胞分為三個(gè)組:空白對(duì)照組(不作任何處理)、陰性對(duì)照組(轉(zhuǎn)染不含GGCX慢病毒的空載體)、轉(zhuǎn)染組(轉(zhuǎn)染含GGCX慢病毒)。檢測(cè)轉(zhuǎn)染成功后分別用q RT-PCR法及Western blot法檢測(cè)各組中軟骨細(xì)胞中GGCX、MMP13、Ⅱ型膠原、Ⅹ型膠原m RNA及蛋白表達(dá)水平。3、運(yùn)用Annexin V-FITCPI法來(lái)檢測(cè)各個(gè)分組中軟骨細(xì)胞的凋亡的情況。4、運(yùn)用茜素紅染色軟骨細(xì)胞進(jìn)行組織學(xué)檢查。研究結(jié)果:1、兔骨關(guān)節(jié)炎的軟骨細(xì)胞在初代中顯現(xiàn)為扁平,多角不規(guī)則,有幾個(gè)隆突,胞核為橢圓形,位于胞體中間。Alcian Blue染色軟骨細(xì)胞表現(xiàn)天藍(lán)色,Ⅱ型膠原纖維染色發(fā)現(xiàn)軟骨細(xì)胞和胞外基質(zhì)表現(xiàn)棕色或黃色。2、q RT-PCR檢測(cè)結(jié)果示:GGCX在轉(zhuǎn)染組中表達(dá)水平明顯升高,MMP13在轉(zhuǎn)染組中的表達(dá)水平明顯降低,Ⅱ型膠原在轉(zhuǎn)染組中表達(dá)明顯升高,X型膠原在轉(zhuǎn)染組中表達(dá)水平亦明顯降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),陰性對(duì)照組以及空白對(duì)照組之間相比較未見(jiàn)顯著差異(P0.05);W-B檢測(cè)結(jié)果顯示:GGCX在轉(zhuǎn)染組中表達(dá)水平明顯升高,MMP13在轉(zhuǎn)染組中的表達(dá)水平明顯降低,Ⅱ型膠原在轉(zhuǎn)染組中表達(dá)水平明顯升高,X型膠原在轉(zhuǎn)染組中表達(dá)水平亦明顯降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),陰性對(duì)照組以及空白對(duì)照組之間相比較未見(jiàn)明顯的差異(P0.05)。3、運(yùn)用Annexin V-FITCPI法檢測(cè)各個(gè)分組凋亡率的結(jié)果顯示:轉(zhuǎn)染組總凋亡率為(17.833±2.612)%,與空白對(duì)照組總凋亡率(25.467±2.623)%以及陰性對(duì)照組總凋亡率(26.167±2.637)%相比明顯降低,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),陰性對(duì)照組以及空白對(duì)照組相比較未見(jiàn)明顯差異存在(P0.05)。4、茜素紅染色結(jié)果顯示:轉(zhuǎn)染組中軟骨基質(zhì)深染,細(xì)胞數(shù)量多,可見(jiàn)少量鈣結(jié)節(jié),空白組和陰性對(duì)照組中軟骨基質(zhì)染色均一,大量鈣結(jié)節(jié)形成。結(jié)論:1、采取前叉韌帶切斷大白兔的韌帶能夠成功造出白兔骨關(guān)節(jié)炎的模型,并能夠成功分離培養(yǎng)出兔膝骨性關(guān)節(jié)炎的軟骨細(xì)胞;2、慢病毒能成功介導(dǎo)GGCX基因轉(zhuǎn)染兔骨性關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞使其表達(dá)顯著增加;3、轉(zhuǎn)染含GGCX慢病毒能夠使軟骨細(xì)胞Ⅱ型膠原的表達(dá)顯著增加;4、轉(zhuǎn)染含GGCX慢病毒能夠使軟骨細(xì)胞MMP13、X型膠原的表達(dá)顯著降低;5、轉(zhuǎn)染含GGCX慢病毒后能夠使骨性關(guān)節(jié)炎中軟骨細(xì)胞的凋亡受到顯著抑制;6、轉(zhuǎn)染含GGCX慢病毒后能夠使骨性關(guān)節(jié)炎鈣結(jié)節(jié)形成受到顯著抑制。
【關(guān)鍵詞】：關(guān)節(jié)軟骨 骨性關(guān)節(jié)炎 GGCX MMP-13 Ⅱ型膠原 X型膠原 免疫組織化學(xué)
【學(xué)位授予單位】：南昌大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R684.3
【目錄】：

• 摘要3-5
• ABSTRACT5-10
• 縮略詞表10-11
• 第1章 前言11-13
• 第2章 材料與方法13-28
• 2.1 材料13-17
• 2.1.1 大耳兔13
• 2.1.2 軟骨細(xì)胞13
• 2.1.3 慢病毒來(lái)源13
• 2.1.4 主要試劑和實(shí)驗(yàn)設(shè)備13-15
• 2.1.5 主要溶液的配制15-17
• 2.2 實(shí)驗(yàn)方法17-28
• 2.2.1 構(gòu)建模型17
• 2.2.2 細(xì)胞分離培養(yǎng)17-19
• 2.2.3 軟骨細(xì)胞的鑒定19-20
• 2.2.4 GGCX轉(zhuǎn)染OA細(xì)胞20-21
• 2.2.5 qRT-PCR法檢測(cè)基因表達(dá)21-23
• 2.2.6 Western-Blot法檢測(cè)目的蛋白表達(dá)23-26
• 2.2.7 AV/PI（Annexin V-FITC & PI）染色分析細(xì)胞凋亡26
• 2.2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理26
• 2.2.9 茜素紅染色軟骨細(xì)胞26-28
• 第3章 實(shí)驗(yàn)結(jié)果28-36
• 3.1 構(gòu)建兔OA模型28
• 3.2 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察和鑒定28-31
• 3.2.1 形態(tài)學(xué)觀察28
• 3.2.2 軟骨細(xì)胞鑒定28-31
• 3.3 qRT-PCR法檢測(cè)GGCX、MMP13、Ⅱ型膠原、X型膠原mRNA表達(dá)31-32
• 3.4 Western-Blot檢測(cè)蛋白32-34
• 3.5 細(xì)胞凋亡檢測(cè)34
• 3.6 茜素紅染色結(jié)果34-36
• 第4章 討論36-39
• 第5章 結(jié)論與展望39-40
• 5.1 結(jié)論39
• 5.2 展望39-40
• 致謝40-41
• 參考文獻(xiàn)41-43
• 綜述 骨性關(guān)節(jié)炎的研究進(jìn)展43-49
• 參考文獻(xiàn)46-49

【相似文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：401594