發(fā)布時(shí)間：2017-05-26 14:14

  本文關(guān)鍵詞：嗜酸乳桿菌對(duì)重型顱腦損傷小鼠小腸鈣敏感通路影響的研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：重型顱腦損傷(Severe head injury,SHI)所致的腸動(dòng)力不足具有發(fā)生早、程度重、持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)的特點(diǎn),其發(fā)生發(fā)展嚴(yán)重影響傷情轉(zhuǎn)歸及預(yù)后。腸動(dòng)力不足不僅嚴(yán)重限制了早期腸內(nèi)營(yíng)養(yǎng)的順利實(shí)施,而且若得不到有效改善后期容易導(dǎo)致?tīng)I(yíng)養(yǎng)不良、誤吸、細(xì)菌移位甚至誘發(fā)MODS等嚴(yán)重并發(fā)癥。促進(jìn)胃腸功能的恢復(fù)能有效阻斷MODS進(jìn)一步發(fā)展,因此積極糾正重型顱腦損傷后腸動(dòng)力不足有益于患者預(yù)后和疾病轉(zhuǎn)歸。腸道收縮的基本單位是平滑肌細(xì)胞(smooth muscle cell,SMC),其中20 kD肌球蛋白輕鏈(20 k D of myosin light chain,MLC20)是調(diào)控平滑肌收縮的重要結(jié)構(gòu)域,其絲氨酸第19號(hào)位點(diǎn)與磷酸基團(tuán)(Pi)結(jié)合后發(fā)生磷酸化,引起粗細(xì)肌絲間相對(duì)移位,拉動(dòng)細(xì)胞發(fā)生收縮。基礎(chǔ)研究表明,MLC20磷酸化過(guò)程受多重信號(hào)級(jí)聯(lián)調(diào)控,鈣依賴(lài)性通路/鈣敏感通路是其中的兩條主要途徑,肌球蛋白輕鏈的磷酸酶(myosin light chain phosphatase,MLCP)結(jié)構(gòu)中活性亞基MYPT1(Myosin phosphatase target subunit 1)的磷酸化過(guò)程是鈣敏感通路的核心環(huán)節(jié),受到通路上游Rho相關(guān)激酶(Rho-associated kinase,ROCK)及Zipper相互作用蛋白激酶(Zipper-interacting protein kinase,ZIPK)等信號(hào)的聯(lián)合調(diào)控,參與多種胃腸動(dòng)力障礙疾病的發(fā)生發(fā)展,然而該通路是否與重型顱腦損傷后腸道動(dòng)力不足有關(guān),尚不清楚。目前臨床針對(duì)重癥患者出現(xiàn)的腸動(dòng)力不足多采用藥物治療,但藥物產(chǎn)生的副作用還會(huì)加重病情。嗜酸乳桿菌(Lactobacillus acidphilus,La)可幫助改善功能性胃腸病、手術(shù)、感染等引起的胃腸動(dòng)力不足,且作用溫和。課題組前期發(fā)現(xiàn),嗜酸乳桿菌可改善重型顱腦損傷后小鼠腸傳輸率,調(diào)節(jié)傷后小腸離體肌條收縮頻率、幅度、張力的異常。結(jié)合前期研究和相關(guān)文獻(xiàn),我們推測(cè):重型顱腦損傷可能導(dǎo)致腸道平滑肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)受損,鈣敏感通路傳導(dǎo)異常,進(jìn)而出現(xiàn)腸道收縮的力量不足;La調(diào)節(jié)SHI后IMD的作用機(jī)制可能與修復(fù)傷后受損的平滑肌細(xì)胞結(jié)構(gòu),調(diào)節(jié)鈣敏感通路中相關(guān)信號(hào)的傳導(dǎo)有關(guān)。本課題旨在研究重型顱腦損傷所致腸動(dòng)力不足產(chǎn)生的分子機(jī)制,選取嗜酸乳桿菌單菌進(jìn)行干預(yù),觀(guān)測(cè)其對(duì)調(diào)節(jié)胃腸動(dòng)力信號(hào)中鈣敏感通路的影響,以進(jìn)一步明確重型顱腦損傷對(duì)胃腸功能的影響以及嗜酸乳桿菌的作用機(jī)制,以期為該類(lèi)益生菌在重癥創(chuàng)傷領(lǐng)域的合理應(yīng)用提供理論參考。一材料與方法1建立重型顱腦損傷致腸動(dòng)力障礙小鼠模型將90只spf級(jí)雄性c57bl/6小鼠隨機(jī)分為假傷組(對(duì)照組)、損傷組(shi+mrs組)、la組(shi+la組),各組又分別有1d、3d、7d三個(gè)時(shí)相點(diǎn)。采用方歡等改良的菲尼自由落體撞擊法,建立重型顱腦損傷后腸動(dòng)力障礙小鼠模型。對(duì)照的假傷組小鼠只打開(kāi)顱骨不進(jìn)行沖擊致傷。假傷組和損傷組每日在相同時(shí)間點(diǎn),灌胃0.5mlmrs(la專(zhuān)用)培養(yǎng)基,la組灌胃等體積la混懸液(含菌量≥1×1010cfu/d),各組其余時(shí)間均自由飲食水。2采用末端回腸組織he染色病理切片,觀(guān)察小腸組織形態(tài)結(jié)構(gòu)等基本病理變化,測(cè)算平滑肌肌層厚度。3采用特異性生物素標(biāo)記的免疫組織化學(xué)染色法,檢測(cè)mlc20、mlc20磷酸化、mlcp、mypt1亞基磷酸化信號(hào)表達(dá)與分布。4采用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法,檢測(cè)小鼠回腸組織內(nèi)mlcp表達(dá)量。5采用rt-pcr手段,檢測(cè)rock、zipk激酶基因表達(dá)水平。二結(jié)果1.小腸組織病理及肌層厚度變化he染色結(jié)果顯示,假傷組小腸全層組織結(jié)構(gòu)完整,形態(tài)正常;shi組小鼠在1d、3d、7d時(shí)組織均出現(xiàn)明顯病理變化,并且隨時(shí)間進(jìn)一步加重,出現(xiàn)腸黏膜上皮局灶性壞死,形成潰瘍,腸黏膜屏障嚴(yán)重受損;肌層厚度明顯變薄(vs.假傷組,1d,3dp0.05,7dp0.01)。嗜酸乳桿菌干預(yù)7d后小腸絨毛形態(tài)、高度、絨毛中段直徑與假傷組無(wú)顯著區(qū)別,間質(zhì)無(wú)水腫及炎癥反應(yīng),肌層未見(jiàn)明顯病理改變,厚度正常。2.mlc20及其磷酸化水平變化免疫組化結(jié)果顯示,mlc20的表達(dá)在三組間無(wú)明顯差異。p-mlc20在shi后1d、3d、7d的水平均明顯降低(vs.假傷組,p0.05);嗜酸乳桿菌干預(yù)1d、3d、7d后p-mlc20顯著升高(vs.shi組,p0.05)。3.mlcp表達(dá)量與組織分布變化elisa結(jié)果顯示,mlcp表達(dá)量在shi后1d、3d、7d的水平均顯著升高(vs.假傷組,p0.01);嗜酸乳桿菌干預(yù)1d、3d、7d后p-mlc20明顯降低(vs.shi組,p0.05)。免疫組化結(jié)果與elisa結(jié)果一致。4.p-mypt1組織分布變化免疫組化結(jié)果顯示,p-mypt1組織分布在shi后1d、3d、7d均出現(xiàn)下降趨勢(shì)(vs.假傷組,P0.01);嗜酸乳桿菌使用后使得1d、3d、7d的p-MYPT1表達(dá)升高(vs.SHI組,P0.01)。5.ROCK基因水平變化PCR結(jié)果顯示,SHI后1d、3d、7d小腸組織ROCK基因表達(dá)均顯著降低(vs.假傷組,P0.01)。使用嗜酸乳桿菌1d后ROCK基因的表達(dá)即顯著升高(vs.SHI組,P0.05);干預(yù)3d和7d后均升高(vs.SHI組,P0.01)。6.ZIPK基因水平變化PCR結(jié)果顯示,SHI后1d、3d、7d小腸組織ZIPK基因表達(dá)均顯著降低(vs.假傷組,P0.01)。使用嗜酸乳桿菌1d和3d后ZIPK基因的表達(dá)升高(vs.SHI組,P0.05);干預(yù)7d后顯著升高(vs.SHI組,P0.01)。并且在La組內(nèi),不同時(shí)間點(diǎn)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。三結(jié)論1.重型顱腦損傷后腸動(dòng)力不足小鼠小腸組織呈現(xiàn)平滑肌肌細(xì)胞排列紊亂,細(xì)胞變性,胞核固縮,炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)和間質(zhì)水腫的組織病理學(xué)改變;同時(shí)出現(xiàn)小腸平滑肌肌層變薄。2.重型顱腦損傷后腸動(dòng)力不足小鼠小腸組織中MYPT1磷酸化水平下降,MLCP表達(dá)量和活性增加,腸道鈣敏感通路異常激活,MLC20磷酸化水平下降;同時(shí)出現(xiàn)ROCK與ZIPK基因表達(dá)水平下降。3.嗜酸乳桿菌的干預(yù)使重型顱腦損傷后腸動(dòng)力不足的小鼠小腸組織病理狀態(tài)得到改善,平滑肌細(xì)胞受損程度減輕,肌層厚度增加。4.使用嗜酸乳桿菌后可以上調(diào)重型顱腦損傷后小腸ROCK與ZIPK基因水平;增加MYPT1的磷酸化,降低MLCP表達(dá)量和分布水平,抑制腸道鈣敏感通路的過(guò)度激活,維持MLC20磷酸化水平。5.嗜酸乳桿菌調(diào)控重型顱腦損傷后腸動(dòng)力不足的作用機(jī)理與調(diào)節(jié)ROCK和ZIPK介導(dǎo)的鈣敏感通路有關(guān)。
【關(guān)鍵詞】：重型顱腦損傷 嗜酸乳桿菌 腸動(dòng)力不足 鈣敏感通路
【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類(lèi)號(hào)】：R651.15
【目錄】：

• 縮略語(yǔ)表4-5
• 英文摘要5-10
• 中文摘要10-13
• 第一章 前言13-17
• 1.1 選題緣由13-14
• 1.2 研究背景14-15
• 1.3 研究目的15
• 1.4 研究?jī)?nèi)容15
• 1.5 研究方法15-16
• 1.6 技術(shù)路線(xiàn)16-17
• 第二章 嗜酸乳桿菌干預(yù)對(duì)重型顱腦損傷小鼠小腸組織病理變化的影響17-28
• 2.1 材料與方法17-21
• 2.2 結(jié)果21-24
• 2.3 討論24-27
• 2.4 小結(jié)27-28
• 第三章 嗜酸乳桿菌干預(yù)對(duì)重型顱腦損傷小鼠小腸ROCK/MLCP通路的影響28-52
• 3.1 資料與方法28-36
• 3.2 結(jié)果36-47
• 3.3 討論47-51
• 3.4 小結(jié)51-52
• 全文總結(jié)52
• 創(chuàng)新點(diǎn)52
• 不足之處52-53
• 參考文獻(xiàn)53-60
• 文獻(xiàn)綜述 ROCK激酶與胃腸疾病的研究進(jìn)展60-72
• 參考文獻(xiàn)66-72
• 攻讀碩士期間的研究成果72-73
• 致謝73

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