發(fā)布時(shí)間：2023-11-11 13:06

　　供體肝臟的嚴(yán)重短缺是限制臨床肝移植的主要瓶頸,利用豬肝臟進(jìn)行異種肝移植是有望解決臨床供肝短缺的有效途徑之一。尤其是作為“過渡肝”應(yīng)用于24h內(nèi)即會(huì)發(fā)生死亡的急性肝衰病人的治療,可以降低病人的死亡率,為后續(xù)治療爭(zhēng)取時(shí)間。豬-人異種肝臟移植面臨諸多障礙,其中超急性免疫排斥反應(yīng)和血小板減少癥是兩個(gè)首要攻克難題。豬α-1,3-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶基因(?-1,3-galactosyltransferase,GGTA1)催化形成的αGal表位抗原,與人體天然存在的αGal表位抗體結(jié)合會(huì)引發(fā)超急性免疫排斥反應(yīng)。表達(dá)于豬肝竇內(nèi)皮細(xì)胞和Kuffer細(xì)胞的去唾液酸糖蛋白受體1(asialoglycoprotein receptor,ASGR1)是誘發(fā)異種肝移植后受體發(fā)生血小板減少癥的主要誘因。本研究利用基因組編輯技術(shù)轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)物核酸酶(Transcription Activator-like(TAL)Effector Nucleases,TALENs)和規(guī)律成簇間隔短回文重復(fù)(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats/Cas9,...

【文章頁數(shù)】：68 頁

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
英文縮略表
1 前言
    1.1 異種肝移植研究進(jìn)展
    1.2 超急性免疫排斥反應(yīng)
    1.3 血小板減少癥
    1.4 基因組編輯技術(shù)
        1.4.1 ZFN技術(shù)
        1.4.2 TALEN技術(shù)
        1.4.3 CRISPR/Cas9技術(shù)
    1.5 本研究目的與意義
2 TALEN介導(dǎo)的GGTA1基因敲除豬制備
    2.1 實(shí)驗(yàn)材料
        2.1.1 動(dòng)物性材料
        2.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑
        2.1.3 實(shí)驗(yàn)耗材
        2.1.4 實(shí)驗(yàn)儀器設(shè)備
        2.1.5 實(shí)驗(yàn)溶液配制
    2.2 實(shí)驗(yàn)方法
        2.2.1 TALEN載體的構(gòu)建
        2.2.2 體外轉(zhuǎn)錄TALEN mRNA
        2.2.3 轉(zhuǎn)染、篩選及單細(xì)胞克隆鑒定
        2.2.4 GGTA1基因敲除仔豬鑒定
        2.2.5 脫靶分析
        2.2.6 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)仔豬α-Gal表位
        2.2.7 血清裂解實(shí)驗(yàn)
    2.3 結(jié)果與分析
        2.3.1 TALEN打靶載體的構(gòu)建及基因突變效率檢測(cè)
        2.3.2 陽性單細(xì)胞克隆鑒定
        2.3.3 基因敲除豬的鑒定
        2.3.4 脫靶分析
        2.3.5 GGTA1敲除豬α-Gal表位檢測(cè)
        2.3.6 血清裂解反應(yīng)
    2.4 討論
3 CRISPR/Cas9介導(dǎo)的ASGR1基因敲除豬制備
    3.1 實(shí)驗(yàn)材料
        3.1.1 動(dòng)物性材料
        3.1.2 質(zhì)粒與菌株
        3.1.3 實(shí)驗(yàn)試劑及溶液配制
        3.1.4 實(shí)驗(yàn)耗材及主要儀器設(shè)備
    3.2 實(shí)驗(yàn)方法
        3.2.1 CRISPR/Cas9打靶載體的設(shè)計(jì)及構(gòu)建
        3.2.2 sgRNA基因突變效率檢測(cè)
        3.2.3 轉(zhuǎn)染、篩選及單細(xì)胞克隆鑒定
        3.2.4 基因敲除豬的鑒定
        3.2.5 脫靶效應(yīng)分析
        3.2.6 Western Blot檢測(cè)
    3.3 結(jié)果與分析
        3.3.1 sgRNA打靶載體的構(gòu)建及基因突變效率檢測(cè)
        3.3.2 陽性單細(xì)胞克隆鑒定
        3.3.3 敲除豬的鑒定
        3.3.4 脫靶分析
        3.3.5 Western blot檢測(cè)
    3.4 討論
4 全文結(jié)論
參考文獻(xiàn)
致謝
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本文編號(hào)：3862602