骨組織工程是一個涉及到多種學(xué)科的交叉研究領(lǐng)域,在骨缺損、骨不連等疾病的修復(fù)和重建治療方面它已經(jīng)展示了良好的發(fā)展前景。目前,骨組織工程的研究主要集中于以下三個方面:(1)種子細(xì)胞的研究;(2)生物支架材料的研究;(3)工程化骨組織的體外構(gòu)建。細(xì)胞-支架材料復(fù)合物的體外構(gòu)建是骨組織工程中最重要的環(huán)節(jié)之一。我們實驗室有關(guān)“個性化骨組織的細(xì)胞罐培養(yǎng)及其在動物中的應(yīng)用研究”課題也主要圍繞細(xì)胞-支架材料復(fù)合物的體外構(gòu)建進(jìn)行。本論文選擇人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(hBMSCs)作為種子細(xì)胞。我們驗證了hBMSCs在進(jìn)行孔板培養(yǎng)時的增殖能力、成骨分化和成軟骨分化能力,hBMSCs進(jìn)行成骨分化和成軟骨分化后的染色實驗、重要生化指標(biāo)分析和標(biāo)志基因的蛋白表達(dá)檢測均表明,成骨和成軟骨分化組相較于對照組,在細(xì)胞形態(tài)、重要生化指標(biāo)和標(biāo)志基因的蛋白表達(dá)上均發(fā)生了顯著的變化,呈現(xiàn)出明顯的分化趨勢,證實了hBMSCs作為種子細(xì)胞的可行性。本論文針對四種細(xì)胞因子包括促紅細(xì)胞生成素(EPO)、神經(jīng)生長因子(NGF)、胰島素類生長因子-1(IGF-1)和β-干擾素(IFN-β)進(jìn)行誘導(dǎo)hBMSCs成軟骨分化的檢測,篩選出能促進(jìn)hBM...

【文章頁數(shù)】：130 頁

【學(xué)位級別】：博士

【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
中英文對照和縮略詞表
第一章 緒論
    1.1 引言
    1.2 種子細(xì)胞
        1.2.1 種子細(xì)胞的來源
            1.2.1.1 骨
            1.2.1.2 骨膜
            1.2.1.3 骨髓
            1.2.1.4 骨外組織
        1.2.2 種子細(xì)胞的種類
            1.2.2.1 成骨細(xì)胞
            1.2.2.2 間充質(zhì)干細(xì)胞
            1.2.2.3 胚胎干細(xì)胞
            1.2.2.4 基因修飾種子細(xì)胞
    1.3 生物支架材料
        1.3.1 天然生物材料
            1.3.1.1 甲殼素和殼聚糖
            1.3.1.2 膠原和明膠
            1.3.1.3 透明質(zhì)酸
            1.3.1.4 纖維蛋白
            1.3.1.5 海藻酸鹽
            1.3.1.6 淀粉
            1.3.1.7 珊瑚
        1.3.2 人工合成生物材料
            1.3.2.1 羥基磷灰石
            1.3.2.2 磷酸鈣水泥
            1.3.2.3 磷酸三鈣
            1.3.2.4 生物活性玻璃
            1.3.2.5 脂肪族聚酯
            1.3.2.6 聚氨酯
            1.3.2.7 聚酸酐
            1.3.2.8 氨基酸聚合物
            1.3.2.9 氧化乙烯類
        1.3.3 納米材料
        1.3.4 復(fù)合材料
    1.4 工程化骨組織的構(gòu)建
        1.4.1 生物反應(yīng)器
            1.4.1.1 機(jī)械攪拌式生物反應(yīng)器
            1.4.1.2 灌注式生物反應(yīng)器
            1.4.1.3 氣升式生物反應(yīng)器
            1.4.1.4 膜式生物反應(yīng)器
            1.4.1.5 旋轉(zhuǎn)壁式生物反應(yīng)器
            1.4.1.6 微載體型生物反應(yīng)器
            1.4.1.7 體內(nèi)生物反應(yīng)器
        1.4.2 種子細(xì)胞-材料復(fù)合物的三維動態(tài)構(gòu)建
    1.5 骨組織工程的臨床應(yīng)用
    1.6 本論文的研究內(nèi)容及研究意義
        1.6.1 研究內(nèi)容
        1.6.2 研究意義
第二章 人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的增殖和分化能力驗證
    2.1 引言
    2.2 實驗材料
        2.2.1 種子細(xì)胞
        2.2.2 hBMSCs成骨分化和成軟骨分化培養(yǎng)基
        2.2.3 其他試劑，耗材和儀器
    2.3 溶液配制
    2.4 細(xì)胞的基本操作
        2.4.1 細(xì)胞復(fù)蘇
        2.4.2 細(xì)胞傳代
        2.4.3 細(xì)胞凍存
    2.5 實驗方法
        2.5.1 hBMSCs生長的形態(tài)觀察
        2.5.2 hBMSCs增殖的計數(shù)方法
        2.5.3 hBMSCs在孔板平面上的成骨和成軟骨分化
        2.5.4 VON KASSA染色
        2.5.5 Alcain blue染色
        2.5.6 hBMSCs堿性磷酸酶（ALP）活性測定
        2.5.7 hBMSCs糖胺多糖（GAG）總含量測定
        2.5.8 Western blotting方法檢測成骨分化和成軟骨分化標(biāo)記蛋白
        2.5.9 統(tǒng)計分析方法
    2.6 結(jié)果與討論
        2.6.1 hBMSCs增殖時的形態(tài)變化
        2.6.2 hBMSCs增殖的數(shù)量規(guī)律
        2.6.3 hBMSCs分化期間的形態(tài)變化
        2.6.4 hBMSCs分化期間染色檢測結(jié)果與分析
        2.6.5 hBMSCs分化期間相關(guān)生化指標(biāo)檢測結(jié)果與分析
        2.6.6 hBMSCs分化期間相關(guān)標(biāo)志基因蛋白表達(dá)檢測結(jié)果
    2.7 本章小結(jié)
第三章 細(xì)胞因子對HBMSCS分化的影響
    3.1 引言
    3.2 實驗材料
        3.2.1 種子細(xì)胞
        3.2.2 細(xì)胞成軟骨分化培養(yǎng)基
        3.2.3 細(xì)胞因子
        3.2.4 試劑，耗材和儀器
    3.3 實驗方法
        3.3.1 單獨使用四種細(xì)胞因子
        3.3.2 使用IFN-β 和TGF-β3 的不同組合
        3.3.3 使用TGF-β3 和不同濃度IFN-β 的組合
        3.3.4 Alcain blue染色
        3.3.5 hBMSCs糖胺聚糖（GAG）總含量的測定
        3.3.6 成軟骨分化標(biāo)志基因的熒光定量PCR（qRT-PCR）方法檢測
            3.3.6.1 總RNA抽提
            3.3.6.2 去基因組
            3.3.6.3 總RNA純度和完整性檢測
            3.3.6.4 逆轉(zhuǎn)錄
            3.3.6.5 定量PCR
        3.3.7 Western blotting方法檢測成軟骨分化標(biāo)志蛋白
        3.3.8 統(tǒng)計分析方法
    3.4 結(jié)果與討論
        3.4.1 單獨使用四種細(xì)胞因子時對hBMSCs成軟骨分化的影響
        3.4.2 IFN-β 和TGF-β3 的不同組合對hBMSCs成軟骨分化的影響
        3.4.3 TGF-β3 和不同濃度IFN-β 的組合對h BMSCs成軟骨分化的影響
    3.5 本章小結(jié)
第四章 PLGA/TCP材料的體外生物相容性和體內(nèi)生物安全性研究
    4.1 引言
    4.2 實驗材料
        4.2.1 種子細(xì)胞
        4.2.2 細(xì)胞成骨分化培養(yǎng)基
        4.2.3 PLGA/TCP材料
            4.2.3.1 PLGA/TCP材料生理鹽水浸提液
            4.2.3.2 PLGA/TCP材料棉籽油浸提液
        4.2.4 實驗動物
        4.2.5 試劑，耗材和儀器
    4.3 實驗方法
        4.3.1 hBMSCs和PLGA/TCP材料在體外的生物相容性檢驗
            4.3.1.1 hBMSCs在PLGA/TCP材料上的接種和換液
            4.3.1.2 hBMSCs在PLGA/TCP材料上增殖和成骨分化的掃描電鏡檢測
            4.3.1.3 MTT檢測hBMSCs在PLGA/TCP材料上的增殖
            4.3.1.4 hBMSCs在PLGA/TCP材料上成骨分化的ALP酶活性檢測
        4.3.2 PLGA/TCP材料在動物體內(nèi)的生物安全性檢驗
            4.3.2.1 熱原實驗
            4.3.2.2 溶血實驗
            4.3.2.3 急性全身毒性實驗
            4.3.2.4 皮內(nèi)刺激反應(yīng)實驗
            4.3.2.5 皮下植入實驗
        4.3.3 統(tǒng)計分析方法
    4.4 結(jié)果與討論
        4.4.1 hBMSCs和PLGA/TCP材料的生物相容性實驗結(jié)果
            4.4.1.1 hBMSCs在PLGA/TCP材料上增殖的檢測結(jié)果
            4.4.1.2 hBMSCs在PLGA/TCP材料上的成骨分化效果
        4.4.2 PLGA/TCP材料在動物體內(nèi)的生物安全性實驗結(jié)果
            4.4.2.1 PLGA/TCP材料的熱原測試結(jié)果
            4.4.2.2 PLGA/TCP材料的溶血實驗結(jié)果
            4.4.2.3 PLGA/TCP材料的急性全身毒性實驗結(jié)果
            4.4.2.4 皮內(nèi)刺激反應(yīng)實驗結(jié)果
            4.4.2.5 皮下植入實驗結(jié)果
    4.5 本章小結(jié)
第五章 飼喂-培養(yǎng)灌流細(xì)胞罐體外制備成骨和成軟骨復(fù)合物
    5.1 引言
    5.2 實驗材料
        5.2.1 種子細(xì)胞
        5.2.2 hBMSCs成骨分化和成軟骨分化培養(yǎng)基
        5.2.3 細(xì)胞因子
        5.2.4 PLGA/TCP支架
        5.2.5 飼喂-培養(yǎng)灌流細(xì)胞罐系統(tǒng)
        5.2.6 試劑，耗材和儀器
    5.3 實驗方法
        5.3.1 細(xì)胞罐的安裝和無菌測試
        5.3.2 hBMSCs在孔板中的靜態(tài)培養(yǎng)
        5.3.3 hBMSCs和PLGA/TCP支架復(fù)合物在細(xì)胞罐中的動態(tài)培養(yǎng)分化
        5.3.4 掃描電鏡檢測hBMSCs的成骨分化和成軟骨分化狀態(tài)
        5.3.5 ALP酶活性檢測hBMSCs的成骨分化水平
        5.3.6 GAG總含量檢測hBMSCs的成軟骨分化水平
        5.3.7 qRT-PCR方法檢測hBMSCs成骨和成軟骨分化標(biāo)志基因的表達(dá)量
        5.3.8 Western blotting方法檢測hBMSCs成骨和成軟骨分化標(biāo)志蛋白的表達(dá)量
        5.3.9 統(tǒng)計分析方法
    5.4 結(jié)果與討論
        5.4.1 細(xì)胞罐各參數(shù)的實時控制
        5.4.2 細(xì)胞罐中hBMSCs和PLGA/TCP支架復(fù)合物的成骨分化和成軟骨分化效果
    5.5 本章小結(jié)
結(jié)論與展望
參考文獻(xiàn)
攻讀博士學(xué)位期間取得的研究成果
致謝
附件



本文編號：3862147