本文關(guān)鍵詞：小腸粘膜下層冷凍凝膠用于細(xì)胞移植支架的研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：研究目的和背景難治性、慢性創(chuàng)傷及組織缺損導(dǎo)致的疼痛、生理功能缺失、容貌的改變嚴(yán)重影響著病人的行動自由和生活質(zhì)量,并進(jìn)一步導(dǎo)致心理和社會問題。當(dāng)自體及同種異體移植受來源、倫理及傳染疾病等限制時,組織工程修復(fù)成為必然的選擇。動物源性的異種生物材料是組織工程材料的研究熱點(diǎn),來源充分,安全可靠,是一種良好的再生組織材料支架,且沒有異體生物材料移植的倫理學(xué)問題,便于進(jìn)行規(guī)�；�、產(chǎn)業(yè)化制備。其中豬小腸黏膜下層(small intestinal submucosa,SIS)有著較低的免疫源性、良好的組織相容性且富含生長因子,是一種較為理想的生物源性材料。但SIS仍存在一下不足:首先SIS為薄膜狀材料,缺乏足夠的三維結(jié)構(gòu),限制了其應(yīng)用領(lǐng)域;其次,SIS結(jié)構(gòu)致密,缺乏疏松的孔徑結(jié)構(gòu),不利于細(xì)胞的遷移爬行及營養(yǎng)物質(zhì)的交換。本研究以SIS為原材料,通過一種新的交聯(lián)改性方法,制備出了具有彈性形變能力和形態(tài)記憶功能的新型組織工程支架材料:SIS冷凍凝膠。通過掃描電鏡觀察其表面及內(nèi)部的結(jié)構(gòu),了解其孔徑大小。比較不同制備參數(shù)的冷凍凝膠吸水率、體外降解率、機(jī)械性能、細(xì)胞毒性,了解冷凍凝膠的形成機(jī)制,優(yōu)選制備條件。通過體外細(xì)胞復(fù)合培養(yǎng)證實(shí)了SIS冷凍凝膠可主動吸附細(xì)胞。細(xì)胞能在支架材料上粘附生長。SIS冷凍凝膠的生物、物理性能良好,抗壓能力強(qiáng),不易碎裂,便于移植。是一種可用于細(xì)胞及藥物移植的支架,在組織重建、創(chuàng)面修復(fù)及注射填充方面有廣泛的應(yīng)用前景。研究方法研究分四部分第一部分:脫細(xì)胞SIS膜的制備及掃描電鏡觀察1.采用機(jī)械刮除及甲醇/氯仿脫脂、胰酶消化、去垢劑漂洗相結(jié)合的辦法制備脫細(xì)胞SIS膜。2.掃描電鏡觀察脫細(xì)胞SIS膜表面結(jié)構(gòu)及有無細(xì)胞殘留。第二部分:脫細(xì)胞SIS粉末的制備及SIS溶液濃度優(yōu)選1.通過低溫粉碎后胃蛋白酶消化、過濾、鹽析、離心、透析、凍干等步驟制備脫細(xì)胞SIS粉末。2.觀察不同濃度的SIS溶液性狀及流動性,凍干制備的海綿形態(tài),優(yōu)選SIS溶液濃度。第三部分:SIS冷凍凝膠的制備及性能評價1.利用自制簡易混勻裝置,采用冷凍交聯(lián)的方法制備了新型生物材料:具有彈性形變和形態(tài)記憶功能的SIS冷凍凝膠。2.掃描電鏡觀察SIS冷凍凝膠的微觀結(jié)構(gòu)及孔徑大小。3.檢測不同EDC濃度制備的冷凍凝膠吸水率、體外降解速率及機(jī)械性能。第四部分:SIS冷凍凝膠體外細(xì)胞復(fù)合培養(yǎng)1.分離培養(yǎng)新生GFP轉(zhuǎn)基因小鼠皮膚成纖維細(xì)胞。2.體外復(fù)合培養(yǎng)后熒光顯微鏡及掃描電鏡觀察。3.以商品化膠原海綿為對照,CCK-8試劑盒檢測不同EDC濃度制備的SIS冷凍凝膠細(xì)胞毒性。研究結(jié)果1.成功制備了脫細(xì)胞SIS膜,掃描電鏡結(jié)果提示SIS表面纖維呈網(wǎng)狀結(jié)構(gòu),未見明顯殘留細(xì)胞形態(tài)。2.脫細(xì)胞SIS粉末呈白色絮狀。2mg/ml、5 mg/ml、10 mg/ml濃度的SIS粉末均可溶解于0.1%醋酸溶液中。SIS濃度越高,材料的形態(tài)及物理性能也越好。但SIS溶液變得越來越粘稠,流動性也越來越差。10mg/ml的濃度溶解已經(jīng)變得較為困難。更高濃度的SIS溶液磁力攪拌器轉(zhuǎn)子已經(jīng)無法轉(zhuǎn)動,溶液不均質(zhì),攪拌過程容易產(chǎn)生氣泡。因此我們優(yōu)選SIS溶液濃度為10mg/ml作為下一步實(shí)驗(yàn)參數(shù)。3.成功制備了具有彈性形變和形態(tài)記憶功能的SIS冷凍凝膠。壓縮形變達(dá)85%以上時仍完好無損,移除外力后可迅速吸水復(fù)原。掃描電鏡提示SIS冷凍凝膠呈多孔結(jié)構(gòu),孔徑大小介于在50-200um之間。平均孔徑大小為:(106.63±28.9)um。隨著交聯(lián)制備的EDC濃度升高,SIS冷凍凝膠吸水率不變、降解速率減緩、機(jī)械性能提高。優(yōu)選EDC制備濃度為30m M-50m M。4.通過無菌紗布擠壓排除并吸走內(nèi)部的水分可使SIS冷凍凝膠變扁,滴加細(xì)胞懸液后可迅速主動回彈吸附細(xì)胞。GFP轉(zhuǎn)基因小鼠成纖維細(xì)胞體外復(fù)合培養(yǎng),熒光顯微鏡及掃描電鏡結(jié)果均顯示SIS冷凍凝膠有利于細(xì)胞的生長粘附,細(xì)胞存在與支架的表面及孔壁上,呈線性、紡錘形扁平結(jié)構(gòu)。有大量偽足長出,部分融合成片。CCK-8試劑盒檢測提示不同EDC濃度交聯(lián)制備的SIS冷凍凝膠吸光度相同,與商品化膠原海綿支架材料無明顯差異。結(jié)論1.通過自制簡易混勻裝置,利用水溶性零長度EDC交聯(lián)劑,采用冷凍交聯(lián)方法制備的SIS冷凍凝膠具有彈性形變和形態(tài)記憶功能,是一種可注射、可降解的支架材料。較目前國外所報道的冷凍凝膠制備方法更簡便,交聯(lián)條件更易控制,不需要接枝額外化學(xué)基團(tuán),避免了化工試劑的潛在生物毒性。2.SIS冷凍凝膠具有孔隙相通的多孔結(jié)構(gòu),有利于細(xì)胞的遷移爬行和營養(yǎng)物質(zhì)的交換。不同EDC濃度制備的冷凍凝膠吸水率相同,體外降解速率、機(jī)械性能不同。優(yōu)選EDC濃度為30m M-50m M。3.EDC濃度對SIS冷凍凝膠細(xì)胞毒性無影響。細(xì)胞可在支架表面及孔壁上粘附生長。
【關(guān)鍵詞】：小腸粘膜下層 支架 冷凍凝膠
【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R622
【目錄】：

• 英文縮略語表5-7
• 英文摘要7-10
• 中文摘要10-13
• 第一章 前言13-15
• 第二章 脫細(xì)胞SIS膜的制備及掃描電鏡觀察15-20
• 2.1 實(shí)驗(yàn)材料15-16
• 2.2 實(shí)驗(yàn)方法16-17
• 2.3 結(jié)果17-19
• 2.4 討論19-20
• 第三章 脫細(xì)胞SIS粉末的制備及SIS溶液濃度優(yōu)選20-27
• 3.1 實(shí)驗(yàn)材料20-21
• 3.2 實(shí)驗(yàn)方法21-24
• 3.3 結(jié)果24-25
• 3.4 討論25-27
• 第四章 SIS冷凍凝膠的制備及性能評價27-38
• 4.1 實(shí)驗(yàn)材料27-29
• 4.2 實(shí)驗(yàn)方法29-32
• 4.3 結(jié)果32-36
• 4.4 討論36-38
• 第五章 SIS冷凍凝膠體外細(xì)胞復(fù)合培養(yǎng)38-46
• 5.1 實(shí)驗(yàn)材料38-39
• 5.2 實(shí)驗(yàn)方法39-41
• 5.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果41-44
• 5.4 討論44-46
• 全文總結(jié)46-47
• 參考文獻(xiàn)47-50
• 文獻(xiàn)綜述 小腸粘膜下層細(xì)胞外基質(zhì)在組織修復(fù)中的作用50-63
• 參考文獻(xiàn)55-63
• 攻讀碩士學(xué)位期間發(fā)表的文章63-64
• 致謝64

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本文編號：383695