目的:通過控制氧氣含量模擬正常髓核細(xì)胞的低氧環(huán)境,研究探討低氧環(huán)境能否誘導(dǎo)大鼠髓核細(xì)胞發(fā)生自噬,并進(jìn)一步研究低氧狀態(tài)下髓核細(xì)胞中缺氧誘導(dǎo)因子-1α分子的表達(dá)量與LC3、Beclin1等自噬標(biāo)志性分子的表達(dá)量是否具有一定的相關(guān)性。方法:取體重均一、無椎間盤退化的健康成年SD大鼠,處死后取其尾骨并提取髓核細(xì)胞,采用差速貼壁法將提取的髓核細(xì)胞純化后予以傳代培養(yǎng),待髓核細(xì)胞傳至第三代時,通過顯微鏡觀察其細(xì)胞形態(tài),然后將第三代髓核細(xì)胞分別予以蘇木精-伊紅染色法和Ⅱ型膠原酶免疫熒光染色法進(jìn)行染色,觀察細(xì)胞形態(tài)及染色結(jié)果完成對于髓核細(xì)胞的鑒定。通過鑒定確定所提取細(xì)胞為大鼠髓核細(xì)胞后,取第三代髓核細(xì)胞,將其隨機分為A、B、C、D 4個組。將A組置于正常氧含量下(37℃、5%CO₂、20%O₂)培養(yǎng);B組置于低氧狀態(tài)下(37℃、5%CO₂、1%O₂)培養(yǎng);C組細(xì)胞首先采用HIF-1α-siRNA轉(zhuǎn)染,然后置于與B組同樣的低氧條件下培養(yǎng);D組髓核細(xì)胞則是將自噬抑制劑3-MA^[1]加入其內(nèi),然后同樣...

【文章頁數(shù)】：60 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
前言
研究材料與方法
    1.實驗動物及主要試劑、儀器
        1.1 實驗動物
        1.2 實驗試劑
        1.3 實驗儀器
    2.大鼠髓核細(xì)胞分離培養(yǎng)及鑒定
        2.1 大鼠髓核組織的分離
        2.2 大鼠髓核細(xì)胞的提取
        2.3 大鼠髓核細(xì)胞的傳代與培養(yǎng)
        2.4 差速貼壁法純化大鼠髓核細(xì)胞
        2.5 大鼠髓核細(xì)胞的凍存與復(fù)蘇
        2.6 大鼠髓核細(xì)胞鑒定
    3.實驗分組和方法
        3.1 大鼠髓核細(xì)胞的轉(zhuǎn)染
        3.2 大鼠髓核細(xì)胞的實驗分組
        3.3 大鼠髓核細(xì)胞總蛋白與RNA的提取
        3.4 Western blot實驗步驟
        3.5 實時熒光定量PCR實驗步驟
    4.實驗的觀測指標(biāo)
        4.1 Western blot檢測HIF-1α與自噬相關(guān)分子蛋白表達(dá)
        4.2 實時熒光定量PCR檢測HIF-1α與自噬相關(guān)分子m RNA表達(dá)
    5.統(tǒng)計學(xué)方法
結(jié)果
    1.大鼠髓核細(xì)胞形態(tài)觀察及鑒定
    2.Western blot檢測HIF-1α與自噬相關(guān)分子蛋白表達(dá)
    3.q RT-PCR檢測大鼠髓核細(xì)胞中HIF-1α與自噬相關(guān)基因表達(dá)
討論
結(jié)論
參考文獻(xiàn)
綜述
    1 腰椎間盤退變性疾病的發(fā)病機制
    2 髓核細(xì)胞低氧環(huán)境與缺氧誘導(dǎo)因子
    3 低氧環(huán)境與髓核細(xì)胞的凋亡
    4 低氧環(huán)境與髓核細(xì)胞的自噬
    5 總結(jié)與展望
    參考文獻(xiàn)
作者簡介及讀研期間主要科研成果
致謝



本文編號：3748812