目的:通過構(gòu)建攜帶熱休克蛋白90α功能性F-5基因的慢病毒載體,并用慢病毒轉(zhuǎn)染人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞,來探索熱休克蛋白90α功能性F-5基因結(jié)合人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)糖尿病大鼠慢性創(chuàng)面的治療效果,并驗(yàn)證其有效性,為治療糖尿病慢性創(chuàng)面提供新的有效的治療手段及方法,為臨床上應(yīng)用休克蛋白90α功能性F-5基因表達(dá)產(chǎn)物治療糖尿病創(chuàng)面提供新的思路。方法:1、攜帶熱休克蛋白90αF-5基因的過表達(dá)慢病毒載體的制備、病毒包裝與滴度檢測(cè):首先需要構(gòu)建攜帶目的基因的載體質(zhì)粒,可以選擇含有綠色熒光蛋白基因和抗藥物篩選基因的工具載體GV358,將事先經(jīng)過PCR擴(kuò)增的目的基因片段交換入線性表達(dá)載體,并在感受態(tài)細(xì)胞中完成轉(zhuǎn)化,最終獲取質(zhì)粒。獲取質(zhì)粒后進(jìn)行陽性克隆PCR鑒定,用以確定質(zhì)粒含有目的基因片段;并用蛋白印跡法檢測(cè)質(zhì)粒的目的基因是否能正常表達(dá)對(duì)應(yīng)蛋白。上述制備好的工具載體質(zhì)粒GV358與輔助質(zhì)粒Helper1.0、Helper2.0一起,轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞,完成病毒的包裝。通過反復(fù)離心的方式收獲病毒、濃縮純化病毒;并用通過觀察物理指標(biāo)、滴度指標(biāo),對(duì)病毒質(zhì)量進(jìn)行檢測(cè)。2、攜帶F-5基因慢病毒轉(zhuǎn)染人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞（... 

【文章頁數(shù)】：106 頁

【學(xué)位級(jí)別】：博士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
引言
材料與方法
    第一部分 :攜帶熱休克蛋白90α“F-5”基因的過表達(dá)慢病毒載體的制備、病毒包裝與滴度檢測(cè)
        1.材料與設(shè)備
        2.攜帶熱休克蛋白90α功能性F-5基因的質(zhì)粒構(gòu)建
        3.蛋白質(zhì)印記法(Western Blot)檢測(cè)質(zhì)粒HSP90AA1 的表達(dá)
        4.慢病毒包裝
    第二部分 攜帶“F-5”基因慢病毒轉(zhuǎn)染人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(hUC-MSCs)
        1.材料
        2.人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(hUC-MSCs)的培養(yǎng)、傳代及凍存
        3.慢病毒轉(zhuǎn)染后細(xì)胞相關(guān)指標(biāo)測(cè)定
    第三部分 關(guān)于糖尿病創(chuàng)面愈合的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究
        1.主要試劑和儀器
        2.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物
        3.實(shí)驗(yàn)方法
    第四部分 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
結(jié)果
    1.攜帶熱休克蛋白90α“F-5”基因的過表達(dá)慢病毒質(zhì)粒的構(gòu)建
    2.慢病毒包裝與滴度測(cè)定
    3.hUC-MSCs的特征
    4.慢病毒轉(zhuǎn)染hUC-MSCs
    5.糖尿病大鼠外觀狀態(tài)觀察
    6.大鼠血糖的變化情況
    7.糖尿病大鼠創(chuàng)面模型外觀形態(tài)觀察
    8.創(chuàng)面愈合情況評(píng)估
    9.HE染色病理切片的觀察
    10.免疫組織化學(xué)染色法觀察創(chuàng)面組織VEGFR2、eNOS的表達(dá)情況
討論
結(jié)論
參考文獻(xiàn)
綜述
    綜述參考文獻(xiàn)
攻讀學(xué)位期間的研究成果
縮略詞表
致謝


【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
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[3]人臍帶干細(xì)胞移植對(duì)大鼠糖尿病足及BDNF表達(dá)的影響[J]. 王瑛,周寧,王慶萍,金醒眆,侯宗柳,彭葆坤,但齊琴,王廷華.  四川大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版). 2013(06)
[4]Trends in prevalence of diabetes in Asian countries[J]. Ambady Ramachandran,Chamukuttan Snehalatha,Ananth Samith Shetty,Arun Nanditha.  World Journal of Diabetes. 2012(06)



本文編號(hào)：3662222