[目的]構建恒河猴反義miR-155（Micro RNA-155,微小RNA-155）慢病毒載體并鑒定,誘導并培養(yǎng)恒河猴未成熟的樹突狀細胞,用重組的反義miR-155慢病毒載體轉染恒河猴未成熟樹突狀細胞,PCR（Polymerase Chain Reaction,聚合酶鏈式反應）檢測miR-155在恒河猴未成熟樹突狀細胞中的表達。[方法]1.將慢病毒載體酶切,與目的基因的退火雙鏈DNA連接,其產物加入感受態(tài)細胞中培養(yǎng)。將培養(yǎng)出的載體進行測序。包裝慢病毒載體,經濃縮純化后,使用藥篩法測定病毒滴度。2.使用恒河猴外周血,通過加入細胞因子GM-CSF（Granulocyte-Macrophage Colony Stimulating Factor,粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子）（1 OOng/ml）、IL-4（Interleukin-4,白細胞介素-4）（50ng/ml）體外誘導并培養(yǎng)恒河猴未成熟的樹突狀細胞,通過流式細胞儀及掃描電鏡進行免疫表型鑒定及超微結構觀察。3.用重組慢病毒載體轉染恒河猴的未成熟樹突狀細胞,RT-qPCR（Real-time Quantitative Polymera... 

【文章來源】：昆明醫(yī)科大學云南省

【文章頁數(shù)】：72 頁

【學位級別】：碩士

【部分圖文】：

圖１．ＧＶ２８０載體圖譜??

ＨＥＫ－２９３細胞完全培養(yǎng)基］ｍｌ，吹勻后使得細胞可以懸浮，隨后將其放入含有二??氧化碳濃度為二十分之一，溫度３７°Ｃ的培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)一天后更換ＨＥＫ－２９３細??胞完全培養(yǎng)基，隨后繼續(xù)進行培養(yǎng)。??ＨＥＫ－２９３細胞的傳代??ＨＥＫ－２９３細胞匯合度到達十分之八到十分之九間進行傳代。??拋棄ＨＥＫ－２９３細胞完全培養(yǎng)基，隨后在６孔板上滴入５ｍｌ滅菌ＰＢＳ液體洗??滌細胞生長面，隨后丟棄該液體。??加入濃度為０．２５％的胰蛋白酶消化液ｌｍｌ，隨后輕晃６０秒到１２０秒，使得??細胞脫落下來，隨后再加入５ｍｌ?ＨＥＫ－２９３細胞完全培養(yǎng)基，并用刻度吸管吹打??幾次，可以使得瓶壁的細胞得到完全沖洗。??２．２．２質粒轉染與慢病毒載體收獲??Ｑｉａｇｅｎ公司的質粒抽提試劑盒中提取到的慢病毒質粒ＤＮＡ有三種，為了測??試其純度，將其置于溶于除菌的ＴＥ緩沖液中，用紫外光吸收法測量，得出所提??取的質粒?ＤＮＡＡ２６０／Ａ２８０?介于?１．８－２．０。??病毒包裝輔助質粒ｐＨｅｌｐｅｒ?１．０載體圖譜：??ｋ?＾＼Ｐ〇??占廠Ｉ?Ｈｅｌｐｅｒｌ?．０?１?＼??ＫＪ??ａｕＢ?ＲＲＥ??圖２．?ｐＨｅｌｐｅｒｌ．Ｏ輔助質粒載體圖譜??１８??

病毒包裝輔助質粒ｐＨｅｌｐｅｒ?２．０載體圖譜：??〇／?Ｈｅｌｐｅｒ２．０?＼??ｉ?５．８?ｋｂ?！??Ｗ??圖３．?ｐＨｅｌｐｅｒ２．０輔助質粒載體圖譜??在轉染開始前２４小時，用含有十分之一胎牛血清的培養(yǎng)基將細胞密度調整??為ｘｌＯ６細胞／１５ｍｌ，與此同時，用胰蛋白酶對對數(shù)生長期的ＨＥＫ－２９３細胞進行??消化，其后，將其重新接種在１０ｃｍ細胞培養(yǎng)皿，最后將其放置于溫度為３７°Ｃ’??二氧化碳濃度為二十分之一的培養(yǎng)箱內，待整一天后細胞密度處于７０％到８０％??的區(qū)間可進行轉染。??轉染前２ｈ更換為無血清培養(yǎng)基。??為了形成轉染混合液，向滅菌離心管內加入ＧＶ２８０載體質粒２０噸、ＰＨｅｌＰｅｒ??１．０載體質粒１５呢、ｐＨｅｌｐｅｒ?２．０載體質粒丨〇ｆｉｇ的ＤＮＡ溶液，并將其與??Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ?２０００轉染試劑混合，使得體積為１ｍｌ，在常溫下培育１５分鐘可??得。??在溫度為３７°Ｃ，二氧化碳濃度為二十分之一環(huán)境下，將ＤＮＡ和??Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ?２０００混合液置于ＨＥＫ－２９３細胞的培養(yǎng)液中培育。??經過６小時的培養(yǎng)丟棄含有混合液的培養(yǎng)基，并加入ＰＢＳ液ｌ〇ｍｌ進行清洗，??輕晃器皿以洗凈殘余混合液。??在溫度為３７°Ｃ，二氧化碳濃度為二十分之一溫箱中加入含有十分之一的胎??牛血清的細胞培養(yǎng)基２０ｍｌ，，培養(yǎng)４８ｈ。??１９??

【參考文獻】：
期刊論文
[1]B cells with regulatory properties in transplantation tolerance[J]. Justine Durand,Elise Chiffoleau.  World Journal of Transplantation. 2015(04)
[2]肝移植術后中長期管理應注意的問題[J]. 竇科峰,張毅.  臨床外科雜志. 2009 (09)
[3]當前肝移植外科應注意的問題[J]. 夏穗生.  中華肝膽外科雜志. 2003(05)



本文編號：3502511