背景骨骼是一個不斷生長、修復(fù)損傷、調(diào)節(jié)體內(nèi)鈣和磷酸鹽代謝的動態(tài)器官。骨感染是骨科領(lǐng)域的嚴(yán)重并發(fā)癥。破骨細(xì)胞是骨骼系統(tǒng)中唯一具有骨吸收能力的細(xì)胞。骨感染如細(xì)菌性關(guān)節(jié)炎、骨髓炎和內(nèi)植物相關(guān)感染可導(dǎo)致破骨細(xì)胞過度激活,導(dǎo)致病理性骨質(zhì)破壞,引起骨折延遲不愈合和不愈合。化膿性鏈球菌（GAS）是引起骨感染的最重要的細(xì)菌之一,可引起化膿性關(guān)節(jié)炎和骨髓炎等相關(guān)骨感染,并導(dǎo)致關(guān)節(jié)和骨的炎性破壞。近年來化膿性鏈球菌引起骨感染不斷增加,了解GAS與骨相互作用對于治療抗生素耐藥性和持續(xù)感染的新型治療策略的發(fā)展至關(guān)重要。鏈球菌溶血素O（SLO）是化膿性鏈球菌分泌的一種標(biāo)志性毒素,大多數(shù)臨床GAS分離株可以檢測到該毒素,并且其在侵襲性感染中過度表達(dá)。然而,SLO在GAS誘發(fā)的骨質(zhì)破壞中的確切作用很大程度上仍然未知。目的因此本次課題以Raw 264.7細(xì)胞作為破骨細(xì)胞前體,采用RANKL+M-CSF作為誘導(dǎo)因子,建立體外誘導(dǎo)破骨細(xì)胞分化模型,探索化膿性鏈球菌溶血素O是否影響OC的分化、細(xì)胞融合以及骨吸收能力;并進(jìn)一步在mRAN及蛋白水平探索OC分化標(biāo)志基因的表達(dá)及其有關(guān)蛋白通路的改變。方法以RANKL+M-CSF為... 

【文章來源】：中國人民解放軍陸軍軍醫(yī)大學(xué)重慶市

【文章頁數(shù)】：48 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【部分圖文】：

破骨細(xì)胞分化染色鑒定

圖 2 Real Time PCR 反應(yīng)設(shè)置參數(shù)3.2.6 Western blotting 檢測 c-fos 和 NFATc1 蛋白表達(dá)（1）蛋白質(zhì)提取1）復(fù)蘇細(xì)胞，并放置于恒溫孵箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞分裂至占培養(yǎng)瓶面積約 80%時，用細(xì)胞刮輕柔刮下細(xì)胞。2）用新鮮培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞濃度，輕柔吹打，使細(xì)胞充分混勻后，接種于 6 孔板（1ml）上，每孔加 1ml。放入培養(yǎng)箱中孵育。3）孵育 10h 后，觀察 6 孔板內(nèi)細(xì)胞貼壁生長良好，細(xì)胞分布均勻，且細(xì)胞形態(tài)大多呈圓形，將孔內(nèi)培養(yǎng)基更換為添加了不同濃度化膿性鏈球菌溶血素O（0、1、2.5μg/ml）的培養(yǎng)基，繼續(xù)在 37℃、5%CO2 條件下培養(yǎng)孵育，48h 后更換細(xì)胞因子、培養(yǎng)基、溶血素 O.4）72h 后，按 IP 細(xì)胞裂解液:PMSF=99:1 的比例配制蛋白提取液，置于冰上備用。5）去除培養(yǎng)板內(nèi)的培養(yǎng)基，用 PBS 清洗后，每孔加入 80μl 蛋白提取液，用細(xì)胞刮刮脫下細(xì)胞，分別收集至 1.5ml 離心管內(nèi)，置于冰上裂解 30 分鐘。

24圖 4 溶血素 O 抑制 RANKL 誘導(dǎo)的 Raw264.7 細(xì)胞骨吸收活性的影響。 A：溶血素 O 抑制OCs 的骨吸收活性及減少骨吸收陷窩的形成。 B:各組吸收面積百分比比較。3.3.3 SLO 抑制 OCs 分化標(biāo)志基因的表達(dá)TRAP 陽性多核細(xì)胞可以表達(dá)破骨細(xì)胞特異基因如 TRAP,MMP9,Integrinβ3CTR,ATP6v60d 及 DC-STAMP。在試驗中，可以觀察到 RANKL 組中上述標(biāo)志性基因表達(dá)量比空白對照組明顯上升，這在 mRNA 水平上說明我們成功建立了體外誘導(dǎo)體系加入 SLO（0.25、0.5、1、2.5μg/ml）誘導(dǎo)破骨細(xì)胞后，破骨細(xì)胞分化相關(guān)特異基因的表達(dá)明顯減少(圖 5)。

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]重慶市收治的汶川地震截肢傷員調(diào)查分析[J]. 楊志金,舒彬,曾登芬.  重慶醫(yī)學(xué). 2009(05)



本文編號：3452504