實體器官移植（Solid Organ Transplantation,SOT）是治療多種終末期器官疾病的有效手段,術(shù)后排斥及感染等并發(fā)癥是影響患者術(shù)后生存期的主要因素。移植受者術(shù)后需要長期服用免疫抑制劑以降低術(shù)后排斥發(fā)生的風(fēng)險,但由于免疫抑制劑的使用,患者術(shù)后感染風(fēng)險相對增加,威脅了患者術(shù)后的生存。目前臨床感染診斷依賴醫(yī)生對患者臨床體征進行初診,再通過臨床標本采集進行進一步檢測。臨床對多種病原微生物的檢測缺乏統(tǒng)一的金標準,且臨床常規(guī)檢測或檢測周期長、特異性弱、靈敏度低等缺陷,無法快速有效檢出器官移植術(shù)后病原微生物。二代測序技術(shù)（Next-Generation Sequencing,NGS）技術(shù)通量大、周期短、高靈敏、強特異,可同步檢測各種病原微生物,對于器官移植術(shù)后免疫抑制,臨床體征微弱、滯后的患者體內(nèi)病原微生物檢測有十分廣闊的應(yīng)用前景。因此,本文建立應(yīng)用二代測序技術(shù)平臺,檢測器官移植術(shù)后感染患者病原微生物的方法,檢測出器官移植術(shù)后主要病原微生物并驗證。建立BKV DNA巢式PCR檢測方法,腎移植患者術(shù)后外周血中BKV DNA的分布情況進行探究。（1）使用二代測序技術(shù)平臺WGS及雜交捕... 

【文章來源】：江蘇大學(xué)江蘇省

【文章頁數(shù)】：119 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【部分圖文】：

器官移植術(shù)后主要病原微生物及其感染時間[26]

7Infection，RTI）（33%）、尿道感染（UrinaryTractInfection，UTI）（18%）、手術(shù)部位感染（Surgical-siteInfection，SSI）（14%）和血流感染（BloodstreamInfection，BSI）（13%）[33]。器官移植手術(shù)院內(nèi)感染也與常規(guī)外科手術(shù)院內(nèi)感染類型類似。圖1-2外科手術(shù)術(shù)后院內(nèi)感染類型及其分布[33]Fig1-2Typesanddistributionofnosocomialinfectionsaftersurgery[33]發(fā)生器官移植術(shù)后院內(nèi)感染時，病原菌的類型不僅受感染發(fā)生部位影響，相同感染部位，不同移植器官的器官移植院內(nèi)感染病原體種類也不盡相同。不同移植器官類型的患者術(shù)后肺炎相關(guān)死亡率在26%-55.6%。細菌是器官移植術(shù)后主要肺部病原微生物。肝移植院內(nèi)呼吸道感染（RTI）發(fā)生率為13.7%-25.4%[34-36]，主要病原體為腸桿菌科、金黃色葡萄球菌、流感嗜血桿菌，銅綠假單胞菌[37,38]；腎移植院內(nèi)呼吸道感染發(fā)生率為4.5%-16%，其中約10%患者肺部感染發(fā)生于移植后早期（術(shù)后1月內(nèi)），主要病原體為銅綠假單胞菌、溶血鏈球菌、金黃色葡萄球菌、流感嗜血桿菌、肺炎克雷伯菌及不動桿菌屬[39,40]；心臟移植院內(nèi)呼吸道感染發(fā)生率為20%-35%[41,42]，病原體包括銅綠假單胞菌、鮑曼不動桿菌、克雷伯菌屬及曲霉菌；肺移植術(shù)后呼吸道感染引發(fā)肺炎的危險較大，約60%的肺移植患者在移植術(shù)后早期存在罹患肺部感染的風(fēng)險。一項研究結(jié)果顯示，30.7%的肺移植患者、9.8%心臟移植患者及40%心肺聯(lián)合移植患者術(shù)后早期發(fā)生了肺部感染。其風(fēng)險顯著高于其他移植類型，其中雙肺移植肺部感染風(fēng)險相對高于單肺移植[43]。肺移植患者術(shù)后肺部感染主要病原物包括銅綠假單胞

13454FLX平臺測序片段較長，達到400bp；Solexa平臺成本更低，同數(shù)據(jù)量下價格僅為454的1/10；SOLID平臺測序準確度更高（≥99.94%），是目前二代測序平臺中準確度最高的。本研究中主要應(yīng)用的是Illumina/SolexaGenomeAnalyzer平臺，該平臺核心技術(shù)為基于DNACluster（DNA簇）的構(gòu)建及可逆末端終止化學(xué)反應(yīng)（ReversibleTerminator）的邊合成邊測序技術(shù)（SequencingBySynthesis，SBS），可以在短時間內(nèi)進行高通量的測序。如圖3所示該技術(shù)首先將基因組DNA進行片段化處理，再將片段化DNA（100-200bp）進行回收，于兩端加入用于與測序芯片結(jié)合的接頭（Adapter），再對帶有接頭的DNA進行變性處理形成單鏈，再令單鏈DNA分子兩端接頭與測序芯片上的接頭引物結(jié)合形成橋狀結(jié)構(gòu)，使用橋式PCR擴增，形成了包含大量Clusters的Flowcell，每個Cluster又含有大量相同的單分子簇，然后對這些模板使用可逆終止化學(xué)反應(yīng)并加入使用不同熒光染料染色的四種dNTP，邊合成邊測序。在每一個被熒光標記的dNTP結(jié)合上DNA鏈時，熒光基團會釋放出對應(yīng)顏色的熒光，測序儀通過捕捉熒光信號，再通過計算機將熒光信號強弱轉(zhuǎn)化為測序峰高，從而獲得待測片段的測序信息。圖1-3.Illumina/SolexaGenomeAnalyzer平臺測序原理示意圖Fig1-3.SchematicdiagramofthesequencingprincipleoftheIllumina/SolexaGenomeAnalyzerplatform


本文編號：3423171