研究背景與目的:細胞外基質的降解與慢性低度炎癥在骨關節(jié)炎（Osteoarthritis,OA）發(fā)病機制中占有重要地位。血管生成素樣蛋白2（Angiopoietin-like2,ANGPTL2）可以促進細胞外基質降解,加速組織重塑并且促進慢性低度炎癥,與OA的發(fā)病機制相似,但無相關研究揭示二者之間的關聯(lián)。本研究的目的在于檢測ANGPTL2在OA軟骨中的表達差異,探究其在OA疾病中的功能及其作用機制。研究方法:首先,熒光定量PCR（q RT-PCR）,蛋白免疫印跡（western blot）和免疫組織化學（immunohistochemistry）用于檢測ANGPTL2在正常軟骨與OA軟骨中的表達差異;從人關節(jié)軟骨中分離軟骨細胞,進行原代軟骨細胞培養(yǎng),用IL-1β刺激軟骨細胞,構建OA體外細胞模型,q RT-PCR和western blot用于檢測ANGPTL2在OA體外細胞模型中的表達差異。然后在體外實驗中,通過敲低ANGPTL2表達與加入人工重組ANGPTL2蛋白（rh ANGPTL2）,從m RNA（q RT-PCR）和蛋白（western blot）水平檢測ANGPTL2促進慢性炎... 

【文章來源】：安徽醫(yī)科大學安徽省

【文章頁數(shù)】：55 頁

【學位級別】：碩士

【部分圖文】：

原代軟骨細胞鑒定A-C細胞II型膠原免疫熒光染色

通過與 12 例正常軟骨標本對比，我們發(fā)現(xiàn)，OA 軟骨中 ANGPTL2 的mRNA 表達高于正常軟骨，見圖 2C。從這些軟骨中取出 5 例 OA 軟骨和 4 例正常軟骨，提取總蛋白，通過免疫印跡技術，我們發(fā)現(xiàn) OA 軟骨中 ANGPTL2 的蛋白表達量同樣高于正常軟骨，見圖 2AB。將 4 例 OA 軟骨和 4 例正常軟骨固定脫鈣，石蠟包埋制成蠟塊，切片后經(jīng)過免疫組化染色，發(fā)現(xiàn)兩種軟骨由深淺至淺層，染色逐漸加深，且 OA 軟骨各層染色明顯較正常軟骨，且主要分布于淺層，見圖 2D。IL-1β刺激軟骨細胞，被廣泛應用于骨關節(jié)炎體外細胞模型的建立[26-28]。我們用從人膝關節(jié)軟骨中分離出原代軟骨細胞，傳代至 P1，鋪六孔板，對照組不作處理，實驗組加入 IL-1β（10ng/ml）刺激，相同環(huán)境下培養(yǎng) 24h，收集細胞提取總蛋白或總 mRNA，經(jīng)過免疫印跡實驗及熒光定量 PCR 檢測，我們發(fā)現(xiàn)，IL-1β刺激軟骨細胞，ANGPTL2 表達增多，見圖 2EFG。綜上，ANGPTL2 在 OA 軟骨病變中，表達 上調(diào)。

安徽醫(yī)科大學碩士學位論文達，便于后續(xù)研究。為了檢驗 siRNA 的沉默效率，我們將軟骨細胞鋪于 6 孔板中，分為四組：1 組 control，2 組 IL-1β組，3 組 siNC+IL-1β組，4 組 siANGPTL2+IL-1β組。鋪板后，待四組軟骨細胞密度至 40-50%時，3 組、4 組分別轉染 siNC 或siANGPTL2 至軟骨細胞內(nèi)，其余組予以更新培養(yǎng)基。四組置于相同壞境培養(yǎng) 24 小時后，2、3、4 組予以 IL-1β刺激，繼續(xù)培養(yǎng) 24 小時，收集四組細胞提取總蛋白或總 mRNA。通過 WB 實驗，我們發(fā)現(xiàn)加 IL-1β刺激后的軟骨細胞 ANGTL2 蛋白表達增多，當轉入 siRNA 后，這種刺激效應明顯減弱，而轉入 siNC 對該刺激無明顯影響，見圖 3A。通過熒光定量 PCR 觀察 mRNA 的變化，與上述現(xiàn)象相似，見圖 3B。由此，我們認為 siRNA 轉染可有效降解 ANGPTL2 的 mRNA，沉默其蛋白表達。


本文編號：3326419