目的:骨關(guān)節(jié)炎（Osteoarthritis,OA）是肌肉骨骼系統(tǒng)中最常見(jiàn)的炎癥性、退行性疾病之一,可導(dǎo)致患者明顯的關(guān)節(jié)功能障礙和生活質(zhì)量下降。預(yù)計(jì)OA在2020年將成為第四大致殘性疾病,給患者造成嚴(yán)重的生活負(fù)擔(dān),并對(duì)家庭及社會(huì)造成巨大的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。盡管近年來(lái)已有大量針對(duì)OA的研究,但因其病理機(jī)制復(fù)雜,目前治療OA的臨床策略任然非常有限。除了物理治療,定期鍛煉和減肥,藥物干預(yù)也僅限于緩解癥狀。在終末期OA,人工關(guān)節(jié)置換術(shù)似乎是唯一可選擇的能有效改善關(guān)節(jié)功能、提高生活質(zhì)量的治療方式。因此,只有進(jìn)一步了解OA發(fā)病的分子機(jī)制,才能為尋找新的特異性治療靶點(diǎn)和治療策略提供理論依據(jù)。Kruppel樣轉(zhuǎn)錄因子2（Kruppel-like factor 2,KLF2）是鋅指類(lèi)Kruppel樣轉(zhuǎn)錄因子家族（Kruppel-like factors,KLFs）的一員,因其在調(diào)控免疫細(xì)胞功能、細(xì)胞增殖、分化中的重要作用而被廣泛研究。既往研究顯示KLF2與一系列炎癥性疾病存在密切聯(lián)系,然而關(guān)于KLF2是否與OA存在相關(guān)性以及KLF2在OA中的作用尚未被詳細(xì)闡述。氧化應(yīng)激被認(rèn)為在OA病理發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮重要作用。有... 

【文章來(lái)源】：中國(guó)醫(yī)科大學(xué)遼寧省

【文章頁(yè)數(shù)】：96 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：博士

【部分圖文】：

軟骨樣本示例圖

中國(guó)醫(yī)科大學(xué)博士學(xué)位論文6骨無(wú)任何損傷或退變征象的區(qū)域�；颊咭话阗Y料見(jiàn)附表1。2.2.2.2光滑軟骨與損傷軟骨樣本的收集第二部分實(shí)驗(yàn)軟骨樣本包含由損傷軟骨樣本和光滑軟骨樣本組成的10對(duì)標(biāo)本，每一對(duì)均來(lái)自同一例在我院行TKA的OA患者。光滑軟骨樣本（關(guān)節(jié)面無(wú)損傷區(qū)域）和損傷軟骨樣本（關(guān)節(jié)面嚴(yán)重受損區(qū)域）是基于Mankin評(píng)分系統(tǒng)來(lái)區(qū)分的[25]（圖1.2）。本部分OA患者納入標(biāo)準(zhǔn)：I符合美國(guó)風(fēng)濕病學(xué)會(huì)關(guān)于膝骨關(guān)節(jié)炎的診斷標(biāo)準(zhǔn)，擬在我院行TKA患者；II術(shù)前影像學(xué)及術(shù)中觀察均顯示患者為明顯單側(cè)間室OA病變；III患者同意捐獻(xiàn)標(biāo)本。OA患者的排除標(biāo)準(zhǔn)：I既往痛風(fēng)、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎或系統(tǒng)性紅斑狼瘡病史；II既往膝關(guān)節(jié)感染史或外傷史；III既往皮質(zhì)類(lèi)固醇藥物治療史或慢性炎癥性疾病史�；颊咭话阗Y料見(jiàn)附表2。圖1.2OA患者光滑軟骨樣本與損傷軟骨樣本術(shù)中示例圖。2.2.2.3OA軟骨樣本的收集第三部分實(shí)驗(yàn)軟骨樣本包含54例OA軟骨。軟骨樣本均采集自在我院行TKA的OA患者。OA患者的納入標(biāo)準(zhǔn)：I符合美國(guó)風(fēng)濕病學(xué)會(huì)關(guān)于膝骨關(guān)節(jié)炎的診斷標(biāo)準(zhǔn)，擬在我院行TKA患者；II患者同意捐獻(xiàn)標(biāo)本。OA患者的排除標(biāo)準(zhǔn)：I既往痛風(fēng)、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎或系統(tǒng)性紅斑狼瘡病史；II既往膝關(guān)節(jié)感染史或外傷史；III既往皮質(zhì)類(lèi)固醇藥物治療史或慢性炎癥性疾病史。膝關(guān)節(jié)取材部位為股骨內(nèi)、外側(cè)髁負(fù)重區(qū)域�；颊咭话阗Y料見(jiàn)附表3。2.2.3軟骨組織總RNA的提�。�1）準(zhǔn)備工作：將抽提總RNA過(guò)程中所要用的器械和耗材放置于0.1%的焦碳酸二乙酯（DEPC）水中浸泡12個(gè)小時(shí)；高壓滅菌、去除殘留的DEPC水，放入烘箱中充分烘干；

中國(guó)醫(yī)科大學(xué)博士學(xué)位論文12和免疫組織化學(xué)法分別檢測(cè)兩組樣本中KLF2，MMP13及COL2A1的mRNA和蛋白表達(dá)水平。首先通過(guò)番紅O染色鑒定兩組軟骨樣本間的組織學(xué)變化。染色實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，正常組的軟骨組織有較多的番紅O著色，而OA軟骨樣本番紅O著色明顯少于正常組（圖1.4A）。這表示OA組的軟骨樣本存在明顯的軟骨退變情況，是OA的典型病理學(xué)改變。Rt-qPCR和免疫組織化學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與正常軟骨組織相比，OA軟骨組織中KLF2的mRNA和蛋白表達(dá)水平顯著降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（圖1.4B、C）。這一結(jié)果與上一部分的芯片分析結(jié)果一致。作為OA發(fā)生發(fā)展中的標(biāo)志性蛋白，我們進(jìn)一步通過(guò)Rt-qPCR和免疫組織化學(xué)法檢測(cè)了兩組樣本中MMP-13和COL2A1的表達(dá)情況。與預(yù)期的一樣，MMP-13在OA軟骨組織中的mRNA和蛋白表達(dá)水平顯著升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。而COL2A1在OA軟骨組織中的mRNA和蛋白表達(dá)水平顯著降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（圖1.4B、D）。圖1.4KLF2的表達(dá)水平在OA軟骨組織中顯著下降。A番紅O/固綠染色對(duì)軟骨組織樣本進(jìn)行組織學(xué)評(píng)價(jià)。BRt-qPCR檢測(cè)軟骨組織樣本中KLF2、MMP-13和COL2A1的mRNA表達(dá)水平。C免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)軟骨組織樣本中KLF2的蛋白表達(dá)水平，右側(cè)柱狀圖為Image-ProPlus定量結(jié)果。D免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)軟骨組織樣本中OAmarker蛋白MMP-13和COL2A1的蛋白表達(dá)水平，右側(cè)柱狀圖為Image-ProPlus定量結(jié)果。數(shù)據(jù)結(jié)果均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差的形式表示，Scalebar=200μm，*P＜0.005，**P＜0.0005。Normal：正常軟骨樣本組，OA：OA軟骨樣本組。

【參考文獻(xiàn)】：
博士論文
[1]MicroRNA-449a調(diào)控在骨關(guān)節(jié)炎中的生物學(xué)作用及機(jī)制研究[D]. 吳建軍.武漢大學(xué) 2018



本文編號(hào)：3290891