軟骨細胞通過產生軟骨,在骨折愈合中發(fā)揮重要作用。軟骨的形成穩(wěn)定了骨折斷端并形成骨痂,從而促進了軟骨內成骨。同時,軟骨細胞產生的各種生長因子在骨折的愈合過程中發(fā)揮重要作用。血管化對于骨折的修復及正常愈合是至關重要的。當血管化被抑制時會嚴重影響骨折修復過程并導致愈合不良,良好的血管化是骨折愈合的保證。本研究探討了軟骨細胞在骨折愈合過程中對血管化的影響以及在這一過程中轉錄因子Fox O1發(fā)揮的作用。實驗首先利用軟骨細胞內Fox O1基因敲除小鼠骨折模型,采用Micro CT,Western blot及免疫熒光法（Immunofluorescence,IF）驗證了模型的成功建立并探討軟骨細胞內Fox O1敲除對小鼠骨折愈合的影響。隨后采用q RT-PCR和IF檢測血管化標志物CD31及血管內皮生長因子（VEGFA）的表達變化,闡述Fox O1基因對軟骨內新生血管的影響。最后,在體外實驗中通過利用染色質免疫共沉淀（Chromatin Immunoprecipitation,Ch IP）技術及雙熒光素酶報告實驗（Luciferase Reporter Assay）,探討軟骨細胞內轉錄因子Fox O... 

【文章來源】：吉林大學吉林省 211工程院校 985工程院校 教育部直屬院校

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【學位級別】：博士

【部分圖文】：

FOXO1結構與翻譯后修飾[130]

3.1 體內驗證軟骨細胞內 FoxO1 敲除對骨折愈合及血管生成的影響3.1.1 驗證條件性基因敲除小鼠骨折模型的構建3.1.1.1 小鼠基因型的驗證本實驗利用 Col2 1Cre 重組酶對軟骨細胞內 FoxO1 進行敲除。有文獻證實Col2 1Cre 轉基因模型可以特異性地刪除軟骨細胞中的幾個固定基因，但不影響其他細胞中該基因的表達[48]。利用基因型檢測對小鼠條件性基因敲除進行驗證，結果結果如圖 3.1 所示，在 Col2 1Cre+實驗組和匹配的 Col2 1Cre-對照小鼠中均檢測到具有側翼 loxP 位點（149bp）的 FoxO1 存在，而僅在具有 Cre 重組酶的小鼠中檢測到了經剪切斷裂的 FoxO（1198bp）。Cre重組酶擴增子（352bp在 Col2 1Cre+實驗組中表達而 Col2 1Cre-對照組小鼠中沒有表達。

吉林大學博士學位論文3.1.1.2 免疫熒光法驗證軟骨內 FoxO1 敲除進一步對Col2 1Cre+實驗組小鼠和Col2 1Cre-對照組小鼠股骨骨折標本進行組織學番紅快綠染色及 FoxO1 免疫熒光檢測。實驗結果如圖 3.2 所示，番紅快綠組織學染色可以清晰的辨別骨折樣本中的骨組織與軟骨組織，其中軟骨被染色成紅色而骨組織被染色為綠色，由此可以確定該樣本中軟骨與骨組織的邊界，確保免疫熒光實驗結果的準確。免疫熒光結果顯示；在 Col2 1Cre-對照組（WT）小鼠中，F(xiàn)oxO1 在骨組織及軟骨組織內均有表達；而在 Col2 1Cre+實驗組（FoxO1 KO）小鼠中，F(xiàn)oxO1 表達僅限于骨組織內，而在軟骨組織內沒有表達。該結果驗證了實驗組小鼠軟骨內 FoxO1 的特異性敲除。


本文編號：3275162