研究背景骨肉瘤是一種最常見的原發(fā)性骨惡性腫瘤,兒童和青少年的發(fā)病率較高,早期侵襲性轉(zhuǎn)移會使骨肉瘤快速進展以及引起不良的預(yù)后,從而導(dǎo)致整體存活率較低。近年來,靶向治療在骨肉瘤的治療中顯示出巨大的潛力,但仍需探索更有效的治療靶標。長非編碼核糖核酸（lncRNA）在癌癥生物學(xué)中起著重要的作用,可以作為調(diào)節(jié)腫瘤轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子,也可以與miRNA作用直接或間接地調(diào)節(jié)目的蛋白的表達。然而,lncRNA在骨肉瘤中的作用仍需更多的探索和研究。特異AT序列結(jié)合蛋白2（SATB2）是一種DNA結(jié)合蛋白,可以特異性結(jié)合核基質(zhì)附著區(qū),并作為染色質(zhì)高級結(jié)構(gòu)域轉(zhuǎn)錄的調(diào)節(jié)劑,且與多種惡性腫瘤中與侵襲、轉(zhuǎn)移和凋亡等過程相關(guān)。我們前期實驗研究初步表明lncRNA-miRNA-mRNA網(wǎng)絡(luò)調(diào)控與骨肉瘤之間存在著潛在聯(lián)系,這為探討骨肉瘤發(fā)生發(fā)展的分子機制提供了新的思路。本課題組擬對lncRNA XLOC-005950與miR-362-5p的靶向作用及miR-362-5p與靶基因SATB2的靶向作用對骨肉瘤侵襲、遷移和凋亡的調(diào)控及生物學(xué)性狀的影響作進一步研究。研究目的本研究通過生物信息學(xué)軟件預(yù)測lncRNA XLOC-0... 

【文章來源】：鄭州大學(xué)河南省 211工程院校

【文章頁數(shù)】：81 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
中英文縮略表
1 引言
2 材料
    2.1 組織來源
    2.2 細胞系與菌株來源
    2.3 質(zhì)粒
    2.4 引物
    2.5 主要實驗試劑
    2.6 主要實驗儀器
    2.7 常用溶液配制
        2.7.1 磷酸緩沖鹽溶液（PBS）
        2.7.2 胰蛋白酶的配置（0.25 %）
        2.7.3 DMEM細胞完全培養(yǎng)基的配置
        2.7.4 考馬斯亮藍染色液的配置（0.25%）
        2.7.5 考馬斯亮藍脫色液的配置
        2.7.6 電泳緩沖液的配置（5×）
        2.7.7 轉(zhuǎn)膜緩沖液的配置（5×）
        2.7.8 TBST緩沖液的配置
        2.7.9 封閉液的配置
        2.7.10 稀釋miR-362 mimics與NC
        2.7.11 LB液體培養(yǎng)基的配置
        2.7.12 LB固體培養(yǎng)基的配置
3 實驗方法
    3.1 細胞培養(yǎng)
        3.1.1 細胞復(fù)蘇
        3.1.2 細胞傳代
        3.1.3 細胞凍存
    3.2 RT-qPCR檢測骨肉瘤組織及其癌旁組織中l(wèi)ncRNA XLOC-005950、SATB2 mRNA和miR3625P的表達水平
        3.2.1 骨肉瘤組織及其癌旁組織中總RNA的提取
        3.2.2 合成cDNA
        3.2.3 qPCR反應(yīng)
    3.3 RT-qPCR檢測細胞中l(wèi)ncRNA XLOC-005950、SATB2 mRNA、VEGF-B和miR3625P的表達水平
        3.3.1 細胞中總RNA的提取
        3.3.2 合成cDNA
        3.3.3 細胞的qPCR反應(yīng)
    3.4 Western Blot檢測骨肉瘤組織及其癌旁組織中SATB2的表達水平
        3.4.1 提取組織中總蛋白
        3.4.2 SDS-PAGE膠
        3.4.3 Western Blot實驗
    3.5 Western Blot檢測細胞中目的蛋白的表達水平
        3.5.1 提取細胞中總蛋白
        3.5.2 SDS-PAGE膠
        3.5.3 Western Blot實驗
    3.6 細胞轉(zhuǎn)染及轉(zhuǎn)染效率檢測
        3.6.1 細胞的轉(zhuǎn)染
        3.6.2 轉(zhuǎn)染效率的檢測
    3.7 CCK-8 實驗檢測細胞增殖
    3.8 Transwell實驗檢測細胞侵襲
    3.9 劃痕實驗檢測細胞遷移
    3.10 流式細胞術(shù)Annexin V/PI雙染檢測細胞凋亡
    3.11 生物信息學(xué)預(yù)測靶基因
    3.12 雙熒光素酶報告實驗驗證匹配結(jié)合作用
        3.12.1 基因組DNA的提取
        3.12.2 野生型及突變型載體構(gòu)建
        3.12.3 雙熒光素酶報告實驗
    3.13 統(tǒng)計學(xué)分析
4 實驗結(jié)果
    4.1 骨肉瘤組織及其癌旁組織中l(wèi)ncRNA XLOC-005950、SATB2及miR3625p的表達水平
    4.2 骨肉瘤細胞系MG63、敲除細胞系MG63~(-/-)和正常人成骨細胞系h FOB1.19中l(wèi)ncRNA XLOC-005950、SATB2及miR3625p的表達水平
    4.3 CCK-8 檢測骨肉瘤細胞系MG63、敲除細胞系MG63~(-/-)和正常人成骨細胞系h FOB1.19 的增殖能力
    4.4 Transwell實驗檢測骨肉瘤細胞系MG63、敲除細胞系MG63~(-/-)和正常人成骨細胞系h FOB1.19 的侵襲能力
    4.5 劃痕實驗檢測骨肉瘤細胞系MG63、敲除細胞系MG63~(-/-)和正常人成骨細胞系h FOB1.19 的遷移能力
    4.6 流式細胞術(shù)Annexin V/PI雙染實驗檢測骨肉瘤細胞系MG63、敲除細胞系MG63~(-/-)和正常人成骨細胞系h FOB1.19 的細胞凋亡
    4.7 驗證骨肉瘤細胞MG63轉(zhuǎn)染miR3625p mimics的效果
    4.8 CCK-8 檢測骨肉瘤細胞系MG63轉(zhuǎn)染miR3625p mimics后的增殖能力31
    4.9 Transwell實驗檢測骨肉瘤細胞系MG63轉(zhuǎn)染miR3625p后的侵襲能力32
    4.10 劃痕實驗檢測骨肉瘤細胞系MG63轉(zhuǎn)染miR3625p mimics后的遷移能力
    4.11 流式細胞術(shù)Annexin V/PI雙染實驗檢測骨肉瘤細胞系MG63轉(zhuǎn)染miR3625p后的細胞凋亡
    4.12 骨肉瘤細胞MG63轉(zhuǎn)染miR3625p mimics后SATB2的表達
    4.13 生物信息學(xué)預(yù)測
    4.14 雙熒光素酶報告實驗驗證lncRNA XLOC-005950、miR3625p和SATB2的匹配作用
        4.14.1 重組載體的測序結(jié)果
        4.14.2 雙熒光素酶報告實驗結(jié)果
5 討論
6 結(jié)論
7 參考文獻
綜述
    參考文獻
個人簡歷
致謝



本文編號：3167659