【目的】:觀察脊髓損傷（SCI）大鼠脊髓內(nèi)移植過表達microRNA-126骨髓間充質(zhì)干細胞（BMSC）后的血管重構(gòu)和炎癥反應情況,初步評估過表達microRNA-126BMSC移植對脊髓損傷治療神經(jīng)功能的促進作用。【方法】:1.全骨髓貼壁法培養(yǎng)骨髓間充質(zhì)干細胞（BMSC）,并鑒定。構(gòu)建并鑒定過表達miR-126慢病毒載體系統(tǒng),經(jīng)293T細胞包裝,篩選穩(wěn)定過表達miR-126的慢病毒并轉(zhuǎn)染BMSC。2.SD大鼠脊髓損傷打擊模型的建立及實驗分組。將108只大鼠隨機分為單純脊髓損傷組（對照組,36只）、脊髓損傷空白載體BMSC移植組（實驗Ⅰ組,36只）,脊髓損傷過表達miR-126BMSC移植組（實驗Ⅱ組,36只）。3.各組大鼠分別于脊髓損傷術(shù)后3天、7天、28天灌注取材,HE染色觀察損傷脊髓形態(tài)及損傷空洞大小,尼氏體染色觀察尼氏體再生情況。4.各組大鼠分別于脊髓損傷術(shù)后1天、3天、7天灌注取材行大鼠內(nèi)皮細胞特異性抗體（RECA-1）和小膠質(zhì)細胞標記物（CD68）的雙重免疫熒光染色。于脊髓損傷術(shù)后1周、4周灌注取材行神經(jīng)軸突（N52）和星形膠質(zhì)細胞（GFAP）的雙重免疫熒光染色。定量分析各... 

【文章來源】：福建醫(yī)科大學福建省

【文章頁數(shù)】：53 頁

【學位級別】：碩士

【部分圖文】：

A:NYUImpactor-Ⅲ打擊器,B:大鼠脊髓打擊造模，C:大鼠造模前暴露T10段脊髓，D:打擊后脊髓充血

19使用SPSS25.0進行數(shù)據(jù)分析。所有測量結(jié)果表示為平均值±標準偏差。當樣本方差不等時，將Welch檢驗用作方差的替代分析。使用Dunnett-T檢驗進行單向方差分析和LSD-t檢驗評價組間差異。顯著性定義為p<0.05的水平。結(jié)果1.實驗動物情況選取的108只SD大鼠，實驗過程中死亡8只，1只死于術(shù)中出血過多，5只死于麻醉過量，另外2只死于膀胱破裂，重新補充后納入數(shù)據(jù)分析。2.分離培養(yǎng)鑒定骨髓間充質(zhì)干細胞（BMSC）并通過慢病毒轉(zhuǎn)染系統(tǒng)構(gòu)建穩(wěn)定表達過表達microRNA-126BMSC。前期已經(jīng)成功完成BMSC的分離培養(yǎng)及鑒定，并成功構(gòu)建慢病毒轉(zhuǎn)染系統(tǒng)并已篩選出穩(wěn)定表達細胞株。3.HE染色HE染色可發(fā)現(xiàn)對照組脊髓打擊損傷后3天，受損傷處脊髓中央灰質(zhì)可見大片出血、尼氏體消失、髓鞘斷裂、細胞空泡樣變性、部分細胞細胞核固縮、大量炎性細胞浸潤，損傷周圍組織出現(xiàn)囊腔樣變化。損傷后7天（如圖2所示），損傷部位出血消失，損傷部位脊髓組織壞死，仍有大量炎性細胞浸潤。損傷后4周，對照組脊髓組織變性嚴重，脊髓灰質(zhì)結(jié)構(gòu)松散，空洞形成，損傷處軸突散亂且稀少。BMSC移植組（實驗I組）與過表達MicroRNA-126BMSC移植組（實驗II組）損傷脊髓處空洞均有不同程度的減校實驗II組空洞面積減小更為明顯。圖2：術(shù)后7天損傷部位脊髓組織HE染色。對照組（A）；實驗I組（B）；實驗II組（C）。標尺100μm4.尼氏體染色

20尼氏體染色（如圖3所示）可觀察到損傷后4周對照組損傷脊髓處結(jié)構(gòu)紊亂，灰質(zhì)白質(zhì)邊界不清，難以發(fā)現(xiàn)正常尼氏體存在。實驗I組損傷脊髓處可觀察到少量尼氏體，但尼氏體體積明顯小于正常。實驗II組可發(fā)現(xiàn)更多尼氏體存在，且體積較實驗I組更接近正常尼氏體體積。圖3：術(shù)后4周損傷部位脊髓組織尼氏體染色。對照組（A）；實驗I組（B）；實驗II組（C）。箭頭所指為染成深藍色的尼氏體。標尺100μm5.免疫熒光染色及定量5.1.術(shù)后脊髓內(nèi)血管和巨噬細胞表達的變化為了探究BMSC移植及過表達MicroRNA-126BMSC移植對于損傷脊髓血管形成及炎癥抑制的影響和兩者之間的相互關(guān)系，在損傷后1天，3天和7天對損傷部位脊髓進行血管指標大鼠內(nèi)皮細胞特異性抗體（RECA-1）和炎癥指標小膠質(zhì)細胞標記物（CD68）的雙重免疫熒光染色（如圖4、5、6所示）。脊髓損傷區(qū)域的邊緣與正常組織交界處是血管新生的主要區(qū)域，我們將觀察的重點集中在這些區(qū)域。在損傷后1天對照組可觀察到少量CD68陽性細胞存在，鮮有RECA-1陽性血管。損傷后3天，對照組[（9.64±1.01）%]可見大量CD68陽性細胞，實驗I組[（7.05±0.44）%]和II組[（5.72±0.62）%]可觀察到炎性細胞數(shù)量顯著少于對照組（P<0.01），實驗II組數(shù)量最少。實驗II組[（2.17±0.16）%]有最高的RECA-1陽性血管密度，實驗I組[（1.81±0.21）%]和對照組[（0.89±0.11）%]陽性血管密度較低,有統(tǒng)計學差異（分別為P<0.05和P<0.01）。損傷后7天實驗II組[（3.82±0.63）%]較實驗I組[（5.62±1.02）%]和對照組[（7.91±0.60）%]有更低密度的CD68陽性細胞（分別為P<0.05和P<0.01），實驗I組較對照組數(shù)量更低，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。實驗II組[（5.01±0.41）%]具有比實驗I組[（3.01±0.20）%]和對照組[（2.63±0.15）%]更高?

【參考文獻】：
期刊論文
[1]急性脊髓損傷動物模型的建立與評估[J]. 吳楊鵬,范筱,張俐.  中國組織工程研究. 2016(49)
[2]不同程度脊髓背側(cè)壓迫損傷模型大鼠脊髓損傷致傷器的設(shè)計[J]. 李劍鋒,馮世慶,夏潤福,閆金玉.  中國組織工程研究. 2015(18)



本文編號：3027816