目的:本研究旨在探索SIRT1對(duì)氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的大鼠髓核細(xì)胞衰老發(fā)生的影響,探明Akt-FoxO1軸在氧化應(yīng)激誘導(dǎo)衰老的過程中調(diào)控SIRT1的機(jī)制,為進(jìn)一步椎間盤退變靶向治療藥物的篩選和臨床治療提供理論依據(jù)。方法:（1）應(yīng)用HE染色、甲苯胺藍(lán)染色和Ⅱ型膠原蛋白免疫熒光染色鑒定原代大鼠髓核細(xì)胞;（2）應(yīng)用ROS檢測(cè)、CCK-8試驗(yàn)、Hoechst染色和流式細(xì)胞檢測(cè)凋亡確定亞致死性的H2O2濃度,建立大鼠衰老髓核細(xì)胞模型;（3）利用定量PCR和Western blot及免疫熒光分析氧化應(yīng)激對(duì)SIRT1表達(dá)的影響;（4）利用特異性藥物激活SIRT1,探明其在氧化應(yīng)激誘導(dǎo)衰老過程中的調(diào)節(jié)機(jī)制;（5）利用Western blot、免疫熒光及特異性藥物探明Akt-FoxO1-SIRT1軸在氧化應(yīng)激誘導(dǎo)衰老過程中的影響及調(diào)節(jié)機(jī)制;（6）利用定量PCR、Western blot及免疫熒光技術(shù)探明白藜通過蘆醇對(duì)氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的大鼠衰老髓核細(xì)胞的影響。結(jié)果:（1）通過三種與髓核細(xì)胞相關(guān)的相對(duì)特異性染色明確所培養(yǎng)的原代細(xì)胞為大鼠髓核細(xì)胞;（2）H2O2是以ROS的形式作用于大鼠NP細(xì)胞,其亞致死性濃度為50-1... 

【文章來源】：蘇州大學(xué)江蘇省

【文章頁(yè)數(shù)】：52 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【部分圖文】：

圖１．大鼠原代髓核細(xì)胞的染色鑒定（比例尺＝５０ｐｍ）??

第二章實(shí)驗(yàn)結(jié)果?ＳＩＲＴ１對(duì)氧化應(yīng)激誘導(dǎo)大鼠髓核細(xì)胞衰老的調(diào)控作用及機(jī)制研宄??建立的體外大鼠ＮＰ細(xì)胞衰老模型中，發(fā)現(xiàn)隨著活性氧的聚集，ＦｏｘＯｌ的表達(dá)逐漸下??降（圖６Ａ）。而ＦｏｘＯｌ的活性由轉(zhuǎn)錄后修飾如磷酸化、乙酰化和泛素化等形式參與??調(diào)節(jié)，這些修飾影響了?ＦｏｘＯｌ的亞細(xì)胞定位、作為轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)器的活性和穩(wěn)定性［１９，??３７］。隨后，我們還發(fā)現(xiàn)在這個(gè)過程中ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ途徑被激活，激活的磷酸化Ａｋｔ（?Ｓｅｒ４７３）??通過翻譯后修飾促進(jìn)了?ＦｏｘＯｌ在Ｓｅｒ２５６位點(diǎn)上的磷酸化（圖６Ａ，Ｂ）。先前有研宄??表明磷酸化的ＦｏｘＯｌ在細(xì)胞質(zhì)中定位并失活［１９，?２０］，因此，我們用免疫熒光法驗(yàn)證??ＦｏｘＯｌ是否在氧化應(yīng)激的作用下在大鼠ＮＰ細(xì)胞中發(fā)生了核質(zhì)穿梭，從結(jié)果中我們發(fā)??現(xiàn)Ｈ２〇２處理組大鼠ＮＰ細(xì)胞核中ＦｏｘＯｌ熒光顯著弱于對(duì)照組，這提示氧化應(yīng)激確實(shí)??明顯抑制了?ＦｏｘＯｌ在大鼠ＮＰ細(xì)胞中的核定位（圖５Ｃ）。??圖６??Ａ?Ｂ????Ｈ；０：?Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ?（ｎＭ）??ｐ－Ａｋｔ（Ｓ４７３）?ｍｍｍ?ＭＷ?６０?＾＾０??—?－?－ｊ?■乃??—＾—－、二－—?＿ｉ５（）??Ｐ－Ｆｏｘ０１（Ｓ２５叫一Ｘ?＿?＿?＿?■ｙｕｐ?｜?？?Ｉ??ＦｏｘＯｌ?一一?８２?｜?｜２－?…??＿，ｎ丨麵＿？?＿蠢叫４５?ｉ＇－｜Ｔ?９｜Ｔｊｎｍ￣??Ｈ２〇２?ｐ－Ａｋｔ?（Ｓ４７３）?Ａｋｔ?ｐ－ＦｏｘＯｌ?（Ｓ２５６）?ＦｏｘＯｌ??ＤＡＰＩ?ＦｏｘＯｌ?Ｍｅｒｇｅ??■■■??圖６．Ｈ２Ｏ２激活ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ通路使ＦｏｘＯｌ發(fā)生磷酸化（比例尺＝

ＳＩＲＴ１對(duì)氧化應(yīng)激誘導(dǎo)大鼠髓核細(xì)胞衰老的調(diào)控作用及機(jī)制研宄?第二章實(shí)驗(yàn)結(jié)果??ＮＰ細(xì)胞。首先，ＭＫ－２２０６抑制了?ｐ－Ａｋｔ的表達(dá)，這使得ＦｏｘＯｌ在Ｓｅｒ２５６位點(diǎn)的磷??酸化下降，并進(jìn)一步導(dǎo)致ＦｏｘＯｌ總蛋白的表達(dá)增加（圖７Ａ，Ｂ）。此外，ＡＳ１８４２８５６??作為ＦｏｘＯｌ的抑制劑，僅通過與ＦｏｘＯｌ結(jié)合而降低其活性，而不影響其轉(zhuǎn)錄［２５］。??在本實(shí)驗(yàn)中，經(jīng)ＡＳ１８４２８５６處理后，ｐ－ＦｏｘＯｌ和ＦｏｘＯｌ蛋白表達(dá)與對(duì)照組比較無顯??著性差異，但與對(duì)照組相比，ｐ－Ａｋｔ的表達(dá)降低（圖７Ａ，?Ｂ）。最后，在ＳＩＲＴ１蛋白??表達(dá)水平上，單純ＭＫ－２２０６處理抑制ｐ－Ａｋｔ活性后促進(jìn)了?ＳＩＲＴ１的表達(dá)，但若ｐ－Ａｋｔ??的表達(dá)被抑制的同時(shí)用ＡＳ１８４２８５６抑制ＦｏｘＯｌ活性，ＳＩＲＴ１的表達(dá)是被抑制，并沒??有如單純ＭＫ－２２０６處理組一樣表達(dá)增加（圖７Ａ，Ｂ）。??圖７??Ａ?ＲａｉＮＰ?ｃｅｌｌｓ?Ｂ??ＡＳ?１８４２８５６?＋?－?＋?§■?Ｃｏｎｔｒｏｌ??ＡＳ?１８４２８５６??ＭＫ－２２０６?－?＋?＋?２?Ｏｎ?Ｂｉ?ＭＫ－２２０６??＿???＊＂?■■?ＡＳＩ８４２８Ｓ６－ＭＫ－２２０６??ｐ－Ａｋｌ（Ｓ４７３）?？?６０?Ｓ?ｇｍ??他丨】ｉ１５．?Ｔ?■?ｉ??ｐ－￣ｆ?ｌｆ＇°ｌｖ?１１｜Ｔ?Ｉ?：｜ｖｋ??Ｆ〇ｘＱ１?二?＊＂＊卜?＾ａＳＪ?Ｉ?ＩＩＩ?Ｉ?Ｉ?Ｉ?ＩＩ??｜＾－ａｃｔｉｎ?１４５?ｐ－Ａｋｔ?（Ｓ４７３）?Ａｋｔ?ｐ－ＦｏｘＯｌ?（Ｓ２５６）?ＦｏｘＯｌ?ＳＩＲＴ１??圖７．Ａｋｔ、ＦｏｘＯｌ和ＳＩＲＴｌ之間存在級(jí)


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