目的:外泌體（exosomes）是近幾年干細胞研究的新突破之一。越來越多的證據(jù)表明干細胞植入治療起主要修復作用的不是干細胞本身,而是其分泌的各種活性物質(zhì),exosomes是這些物質(zhì)中起主導作用的成分。本文主要研究臍帶間充質(zhì)干細胞（umbilical cord-derived mesenchymal stem cells,UC-MSCs）來源的exosomes對退變椎間盤髓核干/祖細胞（degenerative intervertebral disc nucleus pulposus stem/progenitor cells,D-NPMSCs）的作用。主要從細胞的增殖能力、多能性和炎癥細胞因子等方面評估exosomes的作用,并探討其作用機制。方法:采用酶消化法和組織塊法分別從退變髓核組織和健康新生兒臍帶組織中提取D-NPMSCs和UC-MSCs,并擴增培養(yǎng)。使用超高速離心法從收集的UC-MSCs條件培養(yǎng)液提取exosomes,并使用透射電鏡,納米粒子分析系統(tǒng)和免疫印跡的方法對提取的exosomes進行鑒定。將得到的exosomes作用于D-NPMSCs后,流式細胞術(shù)檢測其MSC特異表... 

【文章來源】：暨南大學廣東省 211工程院校

【文章頁數(shù)】：51 頁

【學位級別】：碩士

【部分圖文】：

UC-MSCs來源exosomes納米粒子系統(tǒng)分析濃度圖

暨南大學碩士學位論文254.2exosomes的攝取本實驗采用Dil染色液對exosomes染色后，與細胞共培養(yǎng)8小時，在熒光顯微鏡下觀察exosomes是否在細胞內(nèi)。結(jié)果顯示，在D-NPMSCs細胞內(nèi)觀察到明顯的紅色熒光（圖2），這說明UC-MSCs來源的exosomes和細胞培養(yǎng)可以被D-NPMSCs攝齲圖2將D-NPMSCs與Dil標記的exosome一起孵育8小時，并用熒光顯微鏡觀察。紅色，Dil熒光；藍色，DAPI染色的細胞核。Exosome被D-NPMSCs攝取（標尺：50μm）。4.3exosomes最適作用劑量分析exosomes對D-NPMSCs增殖的最適作用劑量通過CCK8來確定。把exosomes的濃度梯度設(shè)計成0、5、10、20、40、60、80ug/ml，作用72小時后，檢測CCK8的OD值（圖3）。如圖所示，與0μg/ml組相比，exosomes作用后的OD值明顯提高，且呈上升趨勢，表明D-NPMSCs對exosomes具有劑量依賴性·。當exosomes濃度在80μg/ml時，OD值為最大，但與濃度為40μg/ml的值相差不大。根據(jù)實驗最優(yōu)方案，所以本實驗選擇40μg/ml的濃度為最佳濃度，往后各實驗均用這一濃度。從該實驗可以看出exosomes對D-NPMSCs具有促進細胞活性的作用，且隨濃度的升高，細胞活性增強。

暨南大學碩士學位論文26圖3CCK8檢測不同濃度exosomes與D-NPMSCs培養(yǎng)72小時后的細胞活力。數(shù)據(jù)呈現(xiàn)為平均值±SD，n=3（p<0.01）。4.4exosomes對D-NPMSCs的MSC表面標志物的表達影響本實驗前期研究發(fā)現(xiàn)，D-NPMSCs的MSC表面標志物CD105和CD29比健康的NPMSCs的表達明顯降低，導致了D-NPMSCs再生能力的減弱，因此本實驗研究外泌體對D-NPMSCs的MSC表面標志物表達的影響。將D-NPMSCs用exosomes處理72小時后，通過流式細胞術(shù)檢測MSC表面標志物的細胞表達情況。由實驗結(jié)果得，MSC-Exo和對照組相比，CD44和CD73的細胞表達率沒有明顯變化，且細胞表達率大于95%，符合MSC鑒定標準。然而，對照組的CD105和CD29的細胞表達率則低于95%，但MSC-Exo顯著提高CD105和CD29的細胞表達率（圖4）。由此可見，exosomes可以提高D-NPMSCs的MSC表面標志基因的細胞表達率。


本文編號：3013882