目的運(yùn)用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù),在人惡性橫紋肌樣瘤細(xì)胞株G401中敲除p21基因。方法通過(guò)反轉(zhuǎn)錄定量PCR（RT-q PCR）及Western blot檢測(cè)各瘤細(xì)胞株中p21的表達(dá),針對(duì)p21基因作用的功能域,設(shè)計(jì)了靶向人p21基因第3個(gè)外顯子的向?qū)NA（sg RNA）,克隆入lenti CRISPR v2載體。將測(cè)序及酶切鑒定正確的重組質(zhì)粒在293T工具細(xì)胞中制備慢病毒顆粒并感染G401細(xì)胞,使用嘌呤霉素進(jìn)行陽(yáng)性細(xì)胞篩選,顯微鏡下挑取單克隆細(xì)胞團(tuán)并繼續(xù)培養(yǎng)獲得G401單克隆細(xì)胞株。提取單克隆細(xì)胞株RNA及蛋白,利用RT-q PCR及Western blot方法檢測(cè)細(xì)胞株中p21的敲除效果。結(jié)果 p21在人橫紋肌樣瘤細(xì)胞中高表達(dá)。成功構(gòu)建靶向p21基因的lenti CRISPRv2-sg RNA重組慢病毒質(zhì)粒。與對(duì)照組相比,篩選得到的G401亞克隆細(xì)胞系中p21蛋白表達(dá)缺失。結(jié)論針對(duì)難轉(zhuǎn)染的G401細(xì)胞,應(yīng)用CRISPR/Cas9系統(tǒng)成功構(gòu)建了p21基因敲除的穩(wěn)定株,為后續(xù)深入研究p21在人惡性橫紋肌樣瘤中的作用機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。 

【文章來(lái)源】：天津醫(yī)藥. 2016,44(10)

【文章頁(yè)數(shù)】：5 頁(yè)

【文章目錄】：
1 材料與方法
    1.1實(shí)驗(yàn)材料
        1.1.1質(zhì)粒、菌株及細(xì)胞
        1.1.2酶類及主要試劑
        1.1.3其他
    1.2方法
        1.2.1 sg RNA oligo序列的設(shè)計(jì)
        1.2.2 lenti CRISPR v2-p21的構(gòu)建與鑒定
        1.2.3病毒包裝、細(xì)胞感染及單克隆細(xì)胞的獲得
        1.2.4 Western blot及反轉(zhuǎn)錄定量PCR（RT-q PCR）檢測(cè)p21的表達(dá)
    1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法
2 結(jié)果
    2.1 p21在人MRT細(xì)胞中的表達(dá)
    2.2 sg RNA靶點(diǎn)的選擇及寡核苷酸序列
    2.3 重組質(zhì)粒lenti CRISPR v2-p21的測(cè)序及酶切
    2.4 Western blot及RT-q PCR檢測(cè)p21基因敲除的效果
3 討論
    3.1 p21在腫瘤中的雙重作用
    3.2 CRISPR/Cas9慢病毒系統(tǒng)


【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]Oncogenic role of p21 in hepatocarcinogenesis suggests a new treatment strategy[J]. Shogo Ohkoshi,Masahiko Yano,Yasunobu Matsuda.  World Journal of Gastroenterology. 2015(42)
[2]利用CRISPR/Cas9n系統(tǒng)構(gòu)建Asxl2基因敲除的NIH3T3穩(wěn)定細(xì)胞系[J]. 方佳萍,趙秀娟,齊艷,王璽,吳旭東,婁建石.  天津醫(yī)藥. 2015(10)



本文編號(hào)：2991423