第一部分缺氧對(duì)大鼠生長(zhǎng)板軟骨細(xì)胞軟骨表型的影響目的:研究缺氧刺激對(duì)大鼠生長(zhǎng)板軟骨細(xì)胞軟骨表型的影響方法:1.分離獲得大鼠生長(zhǎng)板軟骨細(xì)胞,并利用1%氧濃度刺激大鼠生長(zhǎng)板軟骨細(xì)胞。2.利用CCK-8（Cell Counting Kit-8,細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒-8）法檢測(cè)1%氧濃度缺氧刺激對(duì)生長(zhǎng)板軟骨細(xì)胞增殖的影響。3.利用RT-PCR（Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction,逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)）檢測(cè)時(shí)間梯度下1%氧濃度缺氧刺激后生長(zhǎng)板軟骨細(xì)胞中SOX9（sexdetermining region Y-type high mobility group box protein 9,性別決定區(qū)Y型高遷移率族蛋白9）、CollagenⅡ（Ⅱ型膠原）和Aggrecan（聚集蛋白聚糖）基因水平表達(dá)的影響。4.利用Western blotting（免疫印跡實(shí)驗(yàn)）和免疫熒光的方法檢測(cè)時(shí)間梯度下1%氧濃度缺氧刺激后生長(zhǎng)板軟骨細(xì)胞SOX9、CollagenⅡ和Aggrecan蛋白水平表達(dá)變化。結(jié)果:1.缺氧對(duì)生長(zhǎng)板軟骨細(xì)胞生長(zhǎng)曲線并無(wú)明顯影響。2.缺氧能夠... 

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【學(xué)位級(jí)別】：博士

【部分圖文】：

生長(zhǎng)板軟骨細(xì)胞增殖曲線。在常氧條件(21%O2)和缺氧(1%O2)培養(yǎng)1天、2天和3天,CCK-8細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)檢測(cè)軟骨細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。數(shù)據(jù)表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=3)。

為了研究缺氧對(duì)生長(zhǎng)板軟骨細(xì)胞軟骨特異性標(biāo)記物基因水平表達(dá)的影響,我們利用RT-PCR的方法檢測(cè)SOX9、CollagenⅡ和Aggrecan在內(nèi)的軟骨特異性標(biāo)記物的基因水平表達(dá)情況。如圖所示,RT-PCR結(jié)果顯示缺氧促進(jìn)SOX9、CollagenⅡ和Aggrecan基因水平的表達(dá),并且SOX9和Aggrecan的基因水平表達(dá)在缺氧刺激4小時(shí)時(shí)候達(dá)到峰值。在缺氧(1%O2)培養(yǎng)0,2,4和8小時(shí)的軟骨細(xì)胞中SOX9、CollagenⅡ和Aggrecan的mRNA表達(dá)。數(shù)據(jù)表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=3)并歸一化至對(duì)照組(0小時(shí))。與對(duì)照組(0小時(shí))相比,*P<0.05,**P<0.01和***P<0.001。

為了研究缺氧對(duì)生長(zhǎng)板軟骨細(xì)胞SOX9、CollagenⅡ和Aggrecan蛋白水平的表達(dá)的影響,我們利用Western blotting和免疫熒光的方法檢測(cè)SOX9、CollagenⅡ和Aggrecan蛋白水平表達(dá)情況。如圖2A所示SOX9、CollagenⅡ和Aggrecan的蛋白表達(dá)水平在軟骨細(xì)胞缺氧反應(yīng)中顯著增加。值得注意的是,當(dāng)軟骨細(xì)胞在缺氧條件下干預(yù)達(dá)8小時(shí)后,SOX9、CollagenⅡ和Aggrecan的蛋白表達(dá)水平與干預(yù)4小時(shí)相比有所下調(diào),但SOX9和CollagenⅡ的表達(dá)水平與對(duì)照組相比是有所增加(圖2A和B)。然后通過(guò)免疫熒光研究SOX9和CollagenⅡ的表達(dá)水平,與蛋白質(zhì)和基因表達(dá)結(jié)果一致,通過(guò)暴露于缺氧條件下4小時(shí),軟骨細(xì)胞中的SOX9和CollagenⅡ沉積顯著增加(圖2C和D)。這些結(jié)果表明,缺氧誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞特異性標(biāo)記物在軟骨細(xì)胞中的表達(dá),從而促進(jìn)軟骨形成表型的維持。結(jié)論


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