研究背景:急性創(chuàng)面愈合是外科工作中常見(jiàn)而重要的過(guò)程,創(chuàng)面愈合受多種局部因素或全身?xiàng)l件的共同影響,然而在目前的臨床實(shí)踐中,急性創(chuàng)面的愈合卻缺乏安全有效的治療方法。外泌體在細(xì)胞間信號(hào)傳遞、細(xì)胞調(diào)控方面發(fā)揮著重要作用,外泌體中存在一類(lèi)外泌蛋白CTHRC1,有報(bào)道稱(chēng)此類(lèi)蛋白可以促進(jìn)各類(lèi)組織的愈合。TBC1D3是一種人類(lèi)特異性基因,可以調(diào)控外泌體的釋放。研究目的:研究外泌體及其中的CTHRC1蛋白對(duì)急性創(chuàng)面愈合的影響及其機(jī)制,探索TBC1D3對(duì)外泌體的調(diào)控作用并分析其分子機(jī)制。研究方法:我們首先應(yīng)用聚乙烯醇海綿內(nèi)植物（PVA）小鼠模型以模擬創(chuàng)面修復(fù)內(nèi)環(huán)境并將其作為創(chuàng)面外泌體的來(lái)源,對(duì)外泌體進(jìn)行收集和分析;體外試驗(yàn)驗(yàn)證外泌體與CTHRC1蛋白的功能和安全性;應(yīng)用小鼠創(chuàng)面模型分別對(duì)外泌體和CTHRC1促進(jìn)愈合作用進(jìn)行評(píng)估,并應(yīng)用蛋白組學(xué)分析、流式細(xì)胞技術(shù)、Western Blot和PCR等技術(shù)對(duì)PVA中細(xì)胞、細(xì)胞因子及外泌體進(jìn)行分析,之后應(yīng)用GSI小鼠以探索CTHRC1的作用機(jī)制;最后應(yīng)用慢病毒轉(zhuǎn)染和獲得性轉(zhuǎn)移技術(shù),明確TBC1D3在體內(nèi)外對(duì)外泌體釋放的調(diào)控作用和作用機(jī)制。研究結(jié)果:小鼠PVA模型可... 

【文章來(lái)源】：上海交通大學(xué)上海市 211工程院校 985工程院校 教育部直屬院校

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【學(xué)位級(jí)別】：博士

【部分圖文】：

PVA內(nèi)植物中收集的外泌體蛋白質(zhì)譜、NTA和VFC分析。(A)PVA海綿內(nèi)植?物模型建模,其中從浸潤(rùn)的分泌液中分離EV;(B)使用抗四跨膜蛋白CD9,CD63和CD81的抗體,在7天后對(duì)PVA海綿植?物中釋放的EV進(jìn)?囊泡流式細(xì)胞術(shù)(VFC)分析,結(jié)果分別定義了可洗脫可溶性的囊泡(圖1B,淺灰?)與不溶性囊泡(圖1B,深灰?);(C)在植?PVA后第7天收集的EV上對(duì)整合素亞基和MHC II進(jìn)?的VFC分析,以評(píng)估EV上存在的整合素的概況�？梢�(jiàn)在第1 天和第7天EV之間沒(méi)有觀察到整聯(lián)蛋白的顯著差異;(D)植?后第7天收集的EV(紅?實(shí)線)的NTA結(jié)果顯示平均直徑134.9+/-31.5nm,與第1 天EV(??實(shí)線)平均直徑125+/-23.8nm沒(méi)有顯著差異;(E、F)植?后第1 天和第7天提取的EV的蛋白質(zhì)組學(xué)分析,蛋白質(zhì)?平的變化均以?第1天?平進(jìn)?標(biāo)準(zhǔn)化,并如材料和?法中所述進(jìn)?定量,可見(jiàn)與信號(hào)傳導(dǎo)和膜動(dòng)?學(xué)相關(guān)的蛋白質(zhì)的變化。我們將與第1天相比,第7天EV中表達(dá)增加幅度最?的前10種蛋白質(zhì)(E)與減少幅度最?的10種蛋白質(zhì)的(F)列表進(jìn)?展示。

為了明確創(chuàng)面外泌體負(fù)載的生物學(xué)功能,我們將從植入供體小鼠第7天后的PVA植入物(即供體小鼠PVA)中獲取的外泌體(供體EV),注射入到受體小鼠體內(nèi)預(yù)先植入的新鮮PVA植入物中(如圖2A所示),并使用脂質(zhì)體作為對(duì)照以排除脂質(zhì)的白細(xì)胞募集效應(yīng)[127]。如圖2B-E所示,第7天供體海綿EV的轉(zhuǎn)移(紅色曲線)導(dǎo)致表達(dá)巨噬細(xì)胞標(biāo)記物F4/80和整合素CD11b,CD11c和CD49b陽(yáng)性的創(chuàng)面床單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞數(shù)量的顯著增加。這些觀察結(jié)果證實(shí),源自創(chuàng)面的EV可加速單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞的募集。2.3.5 創(chuàng)面外泌體在小鼠創(chuàng)面愈合體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中促進(jìn)愈合

外泌體可以被創(chuàng)面細(xì)胞內(nèi)化并促進(jìn)創(chuàng)面愈合進(jìn)程。(A)我們將從植?供體小鼠第7 天后的PVA植?物(即供體小鼠PVA)中獲取的外泌體(供體EV),應(yīng)用到預(yù)先建立的受體小鼠創(chuàng)面愈合模型中。(B)將用熒光PKH26標(biāo)記的供體EV獲得性轉(zhuǎn)移?受體小鼠新鮮創(chuàng)面部位,孵育18小時(shí),通過(guò)共聚焦顯微鏡成像,與對(duì)照組對(duì)照比較。圖片顯示EV被創(chuàng)面細(xì)胞攝取后在細(xì)胞內(nèi)聚集。比例尺=60μm。(C)受體小鼠的創(chuàng)面愈合曲線,在加?收集的PVA供體來(lái)源的EV(紅?)與PBS(藍(lán)?)后,隔日記錄創(chuàng)面面積,得出各組小鼠的創(chuàng)面愈合情況。(外泌體組和對(duì)照組組之間:**,P<0.01;***,P<0.001,每組n=6)。


本文編號(hào)：2972130