目的:建立并探討聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-高分辨率熔解曲線（polymerase chain reaction and high resolution melting,PCR-HRM）分析技術(shù)篩查中國漢族人群成骨不全（osteogenesis imperfecta,OI）患者COL1A1/COL1A2基因突變的方法。應(yīng)用PCR-HRM技術(shù)篩查OI患者COL1A1/COL1A2基因突變位點(diǎn),利用Sanger測序驗證,并分析臨床表現(xiàn)型與基因型的關(guān)聯(lián)。方法:1.研究PCR-HRM技術(shù)的最佳反應(yīng)條件,模板（DNA）濃度、PCR-HRM引物設(shè)計及引物濃度、退火溫度（annealing temperature,AT）、循環(huán)數(shù)等。2.應(yīng)用PCR-HRM技術(shù)結(jié)合Sanger測序?qū)?7例患者及對照者進(jìn)行COL1A1/COL1A2基因篩查,有家族史的患者,也要同時進(jìn)行家屬的基因測序驗證。對篩查結(jié)果陽性的患者進(jìn)一步分析其臨床表型及基因型的聯(lián)系。3.在未用PCR-HRM技術(shù)篩查出異常的患者中,隨機(jī)選取其中3例進(jìn)行全基因組測序（whole-genome sequencing,WGS）分析,以確定未檢測出異常的原因。結(jié)果:... 

【文章來源】：天津醫(yī)科大學(xué)天津市 211工程院校

【文章頁數(shù)】：91 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【部分圖文】：

先證者影像資料圖

.3.2 家系 Sanger 測序結(jié)果先證者及其父母的 Sanger 測序結(jié)果顯示，先證者 COL1A1 基因第 45 號外子區(qū)域發(fā)生兩處雜合突變，分別為 c.3235G>A 和 c.3247G>A，分別來自其父，見圖 8。其中，c.3247G>A 經(jīng)核查證實(shí)為單核苷酸多態(tài)性（single nucleotideolymorphism，SNP）位點(diǎn)（rs372029024），但尚無人群發(fā)生率的統(tǒng)計數(shù)據(jù)，其病性也尚未確定；c.3235G>A 在數(shù)據(jù)庫中已有過 17 次報道且為致病突變。先者 COL1A1 基因第 45 號外顯子同時存在兩個突變位點(diǎn)的情況與其他患者的個點(diǎn)突變不同，為首次發(fā)生，該結(jié)果已提交至人類膠原突變數(shù)據(jù)庫，編號為OL1A1_00204，COL1A1_00891。圖 7 家系 PCR-HRM 篩查結(jié)果①：標(biāo)準(zhǔn)熔解曲線；②：差異熔解曲線。曲線 1 為先證者，曲線 2 為先證者父母，曲線 3 為正常組

2.3.3 突變預(yù)測軟件概述選取三種生物信息學(xué)軟件：PolyPhen2，SIFT 和 Align GVGD 預(yù)測 COL1A基因突變引起的氨基酸變化對蛋白功能的影響。Polyphen2 在線網(wǎng)站：http://genetics.bwh.harvard.edu/pph2/，SIFT 在線網(wǎng)站：http://sift.jcvi.org/，Align GVGD 在線網(wǎng)站：http://agvgd.hci.utah.edu/。這三個軟件為在線應(yīng)用的軟件，在預(yù)測錯義突變以及 SNP 而導(dǎo)致的蛋白質(zhì)功能異常方面應(yīng)用廣泛，其他形式如無義突變（突變導(dǎo)致提前形成終止密碼）、堿基插入或缺失所造成的框移突變以及起始密碼子的突變均不可以預(yù)測。因此，以上的使用條件恰好符合我們對于患兒兩處點(diǎn)突變的效應(yīng)進(jìn)行評估，當(dāng)其中至少兩種軟件預(yù)測結(jié)果一致時，可信度更大。圖 8 家系 COL1A1 基因第 45 號外顯子測序結(jié)果①：先證者（c.3235G>A、c.3247G>A）；②：先證者父親（c.3235G>A）；③：先證者母親（c.3247G>A）；④：對照


本文編號：2941481