目的:現(xiàn)有研究證實,Hedgehog(HH)信號通路和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)在胚胎發(fā)育、細胞增殖分化及腫瘤和纖維化性疾病的發(fā)生發(fā)展過程中均發(fā)揮了重要的作用。近期研究發(fā)現(xiàn),它們在病理性瘢痕中也有異常改變,但其具體作用及分子機制尚待闡明。我們課題組前期研究顯示,與信號通路密切相關(guān)的長鏈非編碼RNA(lncRNAs)在病理性瘢痕中的表達譜發(fā)生了明顯變化。本文在此基礎(chǔ)上采用芯片探求篩選瘢痕疙瘩與正常皮膚組織中Hedgehog信號通路和EMT相關(guān)的lncRNAs和mRNAs的差異表達,并進行一系列生物信息學(xué)分析。從新的角度探討瘢痕疙瘩形成的分子機制。為進一步尋找其在臨床治療新靶點提供新思路和理論基礎(chǔ)。方法:分別取整形手術(shù)切除的瘢痕疙瘩表皮和鄰近的正常皮膚表皮,采用Trizol法提取總RNA并進行質(zhì)檢。(1)質(zhì)檢合格后,純化并進行熒光標記、Arraystar人類LncPathTM Hedgehog芯片(8x15K)雜交,然后掃描得到雜交圖片,利用Agilent Feature Extraction v11.0.1.1軟件處理,用Agilent GeneSpring GX v12軟件進行數(shù)據(jù)分析并檢測與Hedgehog信號通路相關(guān)的lncRNAs和mRNAs差異表達譜。分別挑選與HH信號通路相關(guān)的上調(diào)lncRNA:LOC100271722,下調(diào)lncRNA:HNF1A-AS1;相關(guān)的上調(diào)mRNA:SFRP2、WNT7B、HNF1A,下調(diào)mRNA:WIF1,以GAPDH作為內(nèi)參,行熒光定量PCR驗證。對差異表達的mRNAs采用DAVID Bioinformatics Resources6.7進行基因本體(GO)、生物學(xué)通路(Pathway)功能注釋聚類分析,獲得差異mRNA相關(guān)功能的功能富集類。(2)質(zhì)檢合格后,純化并進行熒光標記、Arraystar人類LncPathTM EMT芯片(8x15K)雜交,然后掃描得到雜交圖片,利用Agilent Feature Extraction v11.0.1.1軟件處理,用AgilentGeneSpring GX v12軟件進行數(shù)據(jù)分析并檢測與EMT信號通路相關(guān)的lncRNAs和mRNAs差異表達譜。分別挑選與EMT相關(guān)的上調(diào)lncRNA:AK055628、NR_033321,下調(diào)lncRNA:ENST00000399188;相關(guān)的上調(diào)mRNA:ENST00000304636、NM_006475,下調(diào):NM_053056,以GAPDH作為內(nèi)參,行熒光定量PCR驗證芯片結(jié)果的可靠性。結(jié)合以往文獻報道及各數(shù)據(jù)庫,對差異表達的lncRNA進行亞類分析及靶基因預(yù)測。結(jié)果:(1)篩選出與Hedgehog信號通路相關(guān)的30條lncRNAs和33條mRNAs存在差異表達。與正常皮膚表皮組織比較,在瘢痕疙瘩表皮組織中明顯上調(diào)Lnc RNAs有16條,主要有:AK055628、MIAT、MIR31HG、RP11-264F23.3、AC073257.2等;明顯下調(diào)lncRNAs 14條,主要有:RP11-12M9.3、XLOC_007437、XLOC_009485、RP5-1042I8.7、HNF1A-AS1等。明顯上調(diào)mRNAs 13條,主要有:SFRP2、ANGPT2、APC2、IVL、GLI2等;明顯下調(diào)mRNAs 20條,主要有:WIF1、KRT1、CCND1、BCL2、NOTCH2等。qPCR驗證結(jié)果與芯片檢測結(jié)果一致。GO分析和KEGG通路分析結(jié)果表明上調(diào)的mRNAs參與了細胞增殖、生長及組織重建,下調(diào)的mRNAs參與了細胞死亡、凋亡等生物學(xué)過程。其中在瘢痕疙瘩表皮組織中l(wèi)ncRNA AC073257.2及其靶基因Gli2均上調(diào),通過Arraystar lncRNA數(shù)據(jù)庫預(yù)測調(diào)控(對差異表達的lncRNAs和靶基因mRNAs之間的相關(guān)關(guān)系進行注釋)提示lncRNA AC073257.2可能具有增強子的功能特性,可在轉(zhuǎn)錄水平上正調(diào)控其上游靶基因Gli2的表達從而影響細胞的生長和增殖;在瘢痕疙瘩表皮組織中HNF1A-AS1下調(diào)而其靶基因HNF1A上調(diào),lncRNA HNF1A-AS1可能在轉(zhuǎn)錄或轉(zhuǎn)錄后水平負調(diào)控其鄰近靶基因HNF1A的表達,從而影響瘢痕疙瘩的生長。(2)篩選出與EMT相關(guān)的lncRNAs 26條和mRNAs 39條存在差異表達,與正常皮膚表皮組織比較,在瘢痕疙瘩表皮組織中明顯上調(diào)LncRNAs有9條,主要有:uc001gch.1、AK055628、NR_033321等,明顯下調(diào)lncRNAs 17條主要有:ENST00000399188等;明顯上調(diào)mRNAs 17條,主要有:ENST00000304636、NM_004126、NM_006475等,明顯下調(diào)mRNAs 22條,主要有:NM_053056等。qPCR驗證結(jié)果與芯片檢測結(jié)果具有較好的一致性。lncRNA ENST00000379816可能通過堿基互補配對或者順式作用,調(diào)控其鄰近靶基因MT1B,從而參與上皮增殖分化作用;LncRNA ENST00000399188和ENST00000454001可分別充當EP300與LATS2的增強子,干預(yù)鄰近蛋白編碼基因啟動子的轉(zhuǎn)錄,從而調(diào)控細胞增殖、遷徙及上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化;lncRNA ENST00000573934可通過競爭性內(nèi)源性機制結(jié)合miRNA,調(diào)控其靶基因ETS1、HDAC3、PCBP1和EPB41L5的表達,從而參與調(diào)控瘢痕疙瘩表皮EMT過程。結(jié)論:(1)人瘢痕疙瘩組織與正常皮膚組織比較,與Hedgehog信號通路相關(guān)的lncRNAs與mRNAs有明顯差異性表達;與EMT相關(guān)的lncRNAs與mRNAs有明顯差異性表達,可能與瘢痕疙瘩的發(fā)生發(fā)展及轉(zhuǎn)歸密切相關(guān)。(2)在瘢痕疙瘩組織中上調(diào)的lncRNA AC073257.2具有增強子的功能特性,可能在轉(zhuǎn)錄水平上正調(diào)控其上游靶基因Gli2的表達;下調(diào)的HNF1A-AS1可能在轉(zhuǎn)錄或轉(zhuǎn)錄后水平負調(diào)控其鄰近靶基因HNF1A的表達。(3)在瘢痕疙瘩組織中上調(diào)的lncRNA ENST00000379816可能通過堿基互補配對或者順式作用,調(diào)控其鄰近靶基因MT1B,從而參與上皮增殖分化;下調(diào)的LncRNA ENST00000399188和ENST00000454001可分別充當EP300與LATS2的增強子,干預(yù)鄰近蛋白編碼基因啟動子的轉(zhuǎn)錄,從而影響細胞增殖、遷徙及上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化;上調(diào)的lncRNA ENST00000573934可能通過競爭性內(nèi)源性機制結(jié)合miRNA,調(diào)控其靶基因ETS1、HDAC3、PCBP1和EPB41L5的表達。(4)差異表達的lncRNAs可能通過影響臨近蛋白編碼基因表達、充當增強子或者競爭性內(nèi)源等機制,參與瘢痕疙瘩Hedgehog信號通路和EMT變化,從而導(dǎo)致瘢痕疙瘩的形成和演化。其詳細作用及其分子機制尚待深入探討和闡明。
【學(xué)位單位】：南昌大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R622
【文章目錄】：
摘要
abstract
英文縮寫及中英文對照表
前言
第一部分 瘢痕疙瘩中與Hedgehog信號通路相關(guān)lncRNAs的表達譜分析
    1 材料與方法
        1.1 研究標本
        1.2 實驗試劑與儀器
    2 實驗方法
        2.1 組織總RNA的提取與分離
        2.2 檢測RNA質(zhì)量
        2.3 基因芯片分析、圖像采集和數(shù)據(jù)分析
        2.4 qRCR法驗證LncRNAs芯片檢測結(jié)果的可靠性
        2.5 統(tǒng)計學(xué)分析
    3 結(jié)果
        3.1 RNA質(zhì)檢結(jié)果
        3.2 組織HE染色結(jié)果及雜交圖
        3.3 靶基因的GO分析
        3.4 靶基因的KEGG生物通路富集分析
        3.5 qPCR驗證
    4 討論
    5 結(jié)論
第二部分 瘢痕疙瘩中與上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)LncRNAs的表達研究
    1 材料與方法
        1.1 研究標本
        1.2 實驗試劑與儀器
    2 實驗方法
        2.1 組織總RNA的提取與分離
        2.2 檢測RNA質(zhì)量
        2.3 基因芯片分析、圖像采集和數(shù)據(jù)分析
        2.4 qRCR法驗證LncRNAs芯片檢測結(jié)果的可靠性
        2.5 統(tǒng)計學(xué)分析
    3 結(jié)果
        3.1 RNA質(zhì)檢結(jié)果
        3.2 芯片雜交結(jié)果
        3.3 差異表達lncRNA及其潛在靶向mRNA分析
        3.4 qPCR驗證結(jié)果
    4 討論
    5 結(jié)論
全文小結(jié)
參考文獻
致謝
攻讀學(xué)位期間的研究成果
綜述
    參考文獻

【參考文獻】

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本文編號：2866358