目的:探討IL-10修飾的人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞(IL-10-hAMSCs)在體外共培養(yǎng)對(duì)巨噬細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化及其共培養(yǎng)上清液對(duì)成纖維細(xì)胞纖維化相關(guān)因子表達(dá)的影響,為進(jìn)一步將IL-10-hAMSCs用于創(chuàng)面炎癥調(diào)控及促進(jìn)創(chuàng)面愈合提供前期研究資料。方法:(1)采用胰蛋白酶-膠原酶兩歩消化法提取原代hAMSCs,用含10%FBS的DMEM/F12培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)傳代,過程中利用差速貼壁法純化hAMSCs,經(jīng)過流式細(xì)胞術(shù)、波形蛋白(Vimentin)免疫熒光鑒定hAMSCs。(2)取生長狀態(tài)良好的P3代hAMSCs,按照預(yù)實(shí)驗(yàn)測得的MOI=30向孔板中添加稀釋后病毒液,根據(jù)細(xì)胞狀態(tài)在8~12h后換液。繼續(xù)培養(yǎng)72h后在倒置熒光顯微鏡觀察熒光估計(jì)轉(zhuǎn)染率。(3)分離小鼠皮膚成纖維細(xì)胞,并利用波形蛋白免疫熒光鑒定。腹腔灌洗法提取C57BL/6野生小鼠腹腔巨噬細(xì)胞并利用墨汁吞噬實(shí)驗(yàn)鑒定。經(jīng)過IFN-γ和LPS誘導(dǎo)24 h獲得M1型巨噬細(xì)胞。(4)將上述小鼠腹腔巨噬細(xì)胞與hAMSCs分組共培養(yǎng),實(shí)驗(yàn)組分為:A組:空白對(duì)照組(單純添加培養(yǎng)基)+小鼠腹腔巨噬細(xì)胞組;B組:hAMSC+小鼠腹腔巨噬細(xì)胞組;C組:IL-10-hAMSCs+小鼠腹腔巨噬細(xì)胞組;D組:空質(zhì)粒-hAMSCs+小鼠腹腔巨噬細(xì)胞組;分別于培養(yǎng)0d、1d、3d收集上清,用ELISA法檢測上清液中IL-12、Arg-1及IL-10含量。同時(shí)收集相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)的巨噬細(xì)胞,利用CD16/CD32(M1型巨噬細(xì)胞表面分子)及CD206(M2型巨噬細(xì)胞表面分子)為標(biāo)記,利用流式細(xì)胞術(shù)對(duì)各組巨噬細(xì)胞的M1/M2極化狀態(tài)進(jìn)行檢測。(5)分別取A、B、C、D組培養(yǎng)上清液對(duì)小鼠皮膚成纖維細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng),利用CCK8試劑盒對(duì)A、B、C、D組成纖維細(xì)胞進(jìn)行增殖率檢測,并繪制生長曲線。分別于培養(yǎng)3d和5d兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)收集細(xì)胞,利用qPCR和Western blot對(duì)TGF-β1、I型膠原、III型膠原mRNA表達(dá)情況及蛋白含量進(jìn)行檢測。結(jié)果:(1)利用胰蛋白酶-膠原酶兩歩消化法可獲得大量原代hAMSCs,經(jīng)過差速貼壁法可獲得大量高純度hAMSCs,原代細(xì)胞形態(tài)多樣,呈紡錘狀多突起,短梭形或多角形,排列紊亂,纖維樣生長。經(jīng)過傳代培養(yǎng)后形態(tài)呈長梭形或紡錘狀,旋渦狀生長,具有方向性。P3代羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞(hAMSCs)流式細(xì)胞術(shù)鑒定結(jié)果提示:CD105(98.58%)、CD73(99.54%)、CD44(96.23%)、CD90(96.88%),呈陽性。IL-10-hAMSCs流式細(xì)胞術(shù)鑒定結(jié)果:CD105(96.67%)、CD73(99.67%)、CD44(95.20%)、CD90(98.50%),呈陽性。兩種細(xì)胞CD34+11b、+19+45+HLA-DR均呈陰性表達(dá)。免疫熒光提示Vimentin在hAMSCs中高表達(dá),而不表達(dá)CK19。(2)慢病毒感染P3代hAMSCs細(xì)胞,經(jīng)72h后于倒置熒光顯微鏡下觀察,IL-10慢病毒及空質(zhì)粒感染hAMSCs均表達(dá)均勻的綠色熒光,病毒感染效率可達(dá)到90%。CCK8法繪制生長曲線提示:hAMSCs、空質(zhì)粒-hAMSCs細(xì)胞及IL-10-hAMSCs在經(jīng)歷了1~2天緩慢生長以后,在3~6天進(jìn)入對(duì)數(shù)生長期,第6天進(jìn)入平臺(tái)期,曲線呈現(xiàn)“S”形,轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞增殖能力略有下降。(3)經(jīng)過酶消化法成功獲取大量的成纖維細(xì)胞,體外快速貼壁生長,原代細(xì)胞呈現(xiàn)短棒狀、長梭形、多角形及不規(guī)則形狀。Vimentin免疫熒光提示獲取了較高純度的成纖維細(xì)胞。巨噬細(xì)胞呈橢圓形、短梭形及不規(guī)則形態(tài)等,墨汁吞噬實(shí)驗(yàn)陽性,吞噬百分率可達(dá)89%。(4)hAMSCs及巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)后流式細(xì)胞術(shù)分析結(jié)果:0天各組均以M1型巨噬細(xì)胞表面標(biāo)記為主,A、B、C、D組M1型細(xì)胞百分比為98.20%、99.20%、97.90%、97.20%;第1天各組表型開始變化,A、B、C、D組M1表型百分比95.20%、79%、64.20%、78.50%,其中以C組M1型細(xì)胞比例減少最為明顯;第3天M1型細(xì)胞所占比例:A、B、C、D組分別為90.70%、57.20%、11.20%、55.80%,C組M1型巨噬細(xì)胞較第1天M1型比例明顯減少,88%轉(zhuǎn)化為M2型巨噬細(xì)胞。(5)ELISA法檢測0d、1d、3d空白對(duì)照組共培養(yǎng)上清液中IL-12含量為:474.840±2.978pg/mL、304.415±3.747pg/m L、325.938±12.229pg/mL;hAMSCs組上清液中IL-12含量:473.709±49.485pg/mL、235.248±1.329pg/mL、183.395±11.268pg/mL;IL-10-hAMSCs組IL-12含量:413.131±37.422pg/mL、199.429±0.319pg/mL、138.084±1.491pg/mL;空質(zhì)粒-hAMSCs組上清液中IL-12含量為:421.935±73.823pg/mL、246.828±11.680pg/mL、185.869±8.570pg/mL;空白對(duì)照組上清液中IL-10含量:12.265±0.271pg/mL、17.111±1.244pg/m L、30.106±1.181pg/mL;hAMSCs組上清液中IL-10含量:16.800±2.585pg/mL、35.907±2.155pg/mL、89.128±4.872pg/mL;IL-10-hAMSCs組IL-10含量:13.515±0.716pg/mL、77.906±1.849pg/mL、258.012±5.784pg/mL;空質(zhì)粒-hAMSCs組上清液中IL-10含量為:13.046±1.180pg/mL、35.593±3.467pg/mL、98.469±3.056pg/mL;空白對(duì)照組上清液中Arg-1含量:0.730±0.060ng/mL、0.925±0.083ng/mL、1.137±0.037ng/mL;hAMSCs組上清液中Arg-1含量:0.783±0.033ng/mL、2.342±0.063ng/mL、4.671±0.094ng/mL;IL-10-hAMSCs組Arg-1含量:0.820±0.035ng/mL、5.112±0.191ng/mL、10.920±0.959ng/mL;空質(zhì)粒-hAMSCs組上清液中Arg-1含量為:0.802±0.046ng/mL、2.588±0.372ng/mL、4.995±0.453ng/mL;結(jié)果顯示上清液中Arg-1及IL-10含量隨著培養(yǎng)時(shí)間延長含量逐漸增加,且hAMSCs組、空質(zhì)粒-hAMSCs組、IL-10-hAMSCs組的Arg-1、IL-10表達(dá)量在1、3天相對(duì)于對(duì)照組高,IL-10-hAMSCs組相對(duì)于hAMSCs組、空質(zhì)粒-hAMSCs組表達(dá)量高,并且IL-10-hAMSCs組表達(dá)量升高尤為明顯。IL-12表達(dá)隨著共培養(yǎng)時(shí)間延長含量逐漸降低,hAMSCs組、空質(zhì)粒-hAMSCs組、IL-10-hAMSCs組含量較對(duì)照組降低,IL-10-hAMSCs組的IL-12含量較hAMSCs組、空質(zhì)粒-hAMSCs組降低更為明顯,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。(6)取各組生長狀態(tài)良好的成纖維細(xì)胞利用CCK8試劑盒進(jìn)行細(xì)胞增殖速率檢測,四組成纖維細(xì)胞生長曲線均呈現(xiàn)“S”型,IL-10-hAMSCs組成纖維細(xì)胞增殖速率明顯快于其他三組,hAMSCs組和空質(zhì)粒-hAMSCs組的成纖維細(xì)胞增殖速率快于空白對(duì)照組,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。(7)qPCR檢測出TGF-β1、I型膠原、III型膠原基因相對(duì)于β-actin基因表達(dá)量,各組上清液培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞,隨著培養(yǎng)時(shí)間延長,TGF-β1、I型膠原、III型膠原mRNA相對(duì)表達(dá)量逐漸增加,同一時(shí)間點(diǎn)hAMSCs組、空質(zhì)粒-hAMSCs組、IL-10-hAMSCs組TGF-β1、I型膠原、III型膠原mRNA相對(duì)表達(dá)量均高于對(duì)照組,并且IL-10-hAMSCs組相對(duì)于hAMSCs組、空質(zhì)粒組相對(duì)表達(dá)量更高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。hAMSCs組與空質(zhì)粒-hAMSCs組相比較未見明顯差異(P0.05)。通過Western blot檢測結(jié)果顯示:在第3d和5d,hAMSCs組、空質(zhì)粒-hAMSCs組、IL-10-hAMSCs組的TGF-β1、I型膠原、III型膠原蛋白表達(dá)量隨著培養(yǎng)時(shí)間延長逐漸增加,同一時(shí)間點(diǎn)hAMSCs組、空質(zhì)粒-hAMSCs組、IL-10-hAMSCs組TGF-β1、I型膠原、III型膠原蛋白表達(dá)量均高于空白對(duì)照組,IL-10-hAMSCs組相對(duì)于hAMSCs組、空質(zhì)粒-hAMSCs組相對(duì)表達(dá)量更高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。hAMSCs組與空質(zhì)粒-hAMSCs組相比較未見明顯差異(P0.05)。結(jié)論:1.與hAMSCs相比IL-10-hAMSCs能夠在體外促進(jìn)巨噬細(xì)胞由促炎表型M1型向組織修復(fù)型M2型轉(zhuǎn)化。2.IL-10-hAMSCs與巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)上清液能夠促進(jìn)成纖維細(xì)胞增殖,并上調(diào)成纖維細(xì)胞TGF-β1、I型及III型膠原的表達(dá),有利于促進(jìn)創(chuàng)面早期愈合。
【學(xué)位單位】：遵義醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R64
【部分圖文】：

37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育 4h，4h 后每孔加入 2ml PB顆粒 3 次，顯微鏡下觀察計(jì)數(shù) 100 個(gè)巨噬細(xì)胞，計(jì)算巨噬細(xì)胞胞漿中吞有大小墨粒 5 個(gè)以上的為陽性細(xì)胞，吞噬百分率=陽胞×100%。腔巨噬細(xì)胞與 hAMSCs 分組共培養(yǎng)為：A 組：空白對(duì)照組（單純添加培養(yǎng)基）+小鼠腹腔巨噬細(xì)s+小鼠腹腔巨噬細(xì)胞組；C 組：IL-10-hAMSCs+小鼠腹腔巨噬細(xì)hAMSCs+小鼠腹腔巨噬細(xì)胞組；小鼠腹腔巨噬細(xì)胞培養(yǎng) 3~4 天 M1 型，移除 6 孔板內(nèi)含 IFN-γ及 LPS 的 DMEM/F12 培養(yǎng)基胞及培養(yǎng)基于 Transwell 小室上層（圖 1），加入 DMEM/F12 5％CO2、37 ℃飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。培養(yǎng) 0d后期 ELISA 指標(biāo)檢測，同時(shí)收集相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞進(jìn)行后期

遵義醫(yī)學(xué)院碩士學(xué)位論文 岳鳳3 結(jié)果3.1 hAMSCs 形態(tài)及生長特點(diǎn)原代細(xì)胞細(xì)胞接種 48h 后，hAMSCs 大部分已貼壁，形態(tài)多樣，呈紡錘狀多突起短梭形或多角形，排列紊亂，成纖維細(xì)胞樣生長。培養(yǎng)至第 5～6 天時(shí)，貼壁細(xì)胞合至 90%以上。傳代后 24 小時(shí)基本貼壁，大多呈長梭形，少數(shù)呈現(xiàn)短棒狀，相互聯(lián)，3~5 天細(xì)胞密度可達(dá) 80%～90%，形態(tài)呈長梭形或紡錘狀，旋渦狀生長，具有向性。3~5 天更新一代，隨著傳代次數(shù)增加，細(xì)胞生長速度逐漸變慢，部分細(xì)胞肥大內(nèi)部可見空泡，且出現(xiàn)偽足（圖 2）。

流式細(xì)胞術(shù)hAMSCs表型鑒定
【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2860575