目的:探討IL-10修飾的人羊膜間充質干細胞(IL-10-hAMSCs)在體外共培養(yǎng)對巨噬細胞表型轉化及其共培養(yǎng)上清液對成纖維細胞纖維化相關因子表達的影響,為進一步將IL-10-hAMSCs用于創(chuàng)面炎癥調控及促進創(chuàng)面愈合提供前期研究資料。方法:(1)采用胰蛋白酶-膠原酶兩歩消化法提取原代hAMSCs,用含10%FBS的DMEM/F12培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)傳代,過程中利用差速貼壁法純化hAMSCs,經(jīng)過流式細胞術、波形蛋白(Vimentin)免疫熒光鑒定hAMSCs。(2)取生長狀態(tài)良好的P3代hAMSCs,按照預實驗測得的MOI=30向孔板中添加稀釋后病毒液,根據(jù)細胞狀態(tài)在8~12h后換液。繼續(xù)培養(yǎng)72h后在倒置熒光顯微鏡觀察熒光估計轉染率。(3)分離小鼠皮膚成纖維細胞,并利用波形蛋白免疫熒光鑒定。腹腔灌洗法提取C57BL/6野生小鼠腹腔巨噬細胞并利用墨汁吞噬實驗鑒定。經(jīng)過IFN-γ和LPS誘導24 h獲得M1型巨噬細胞。(4)將上述小鼠腹腔巨噬細胞與hAMSCs分組共培養(yǎng),實驗組分為:A組:空白對照組(單純添加培養(yǎng)基)+小鼠腹腔巨噬細胞組;B組:hAMSC+小鼠腹腔巨噬細胞組;C組:IL-10-hAMSCs+小鼠腹腔巨噬細胞組;D組:空質粒-hAMSCs+小鼠腹腔巨噬細胞組;分別于培養(yǎng)0d、1d、3d收集上清,用ELISA法檢測上清液中IL-12、Arg-1及IL-10含量。同時收集相應時間點的巨噬細胞,利用CD16/CD32(M1型巨噬細胞表面分子)及CD206(M2型巨噬細胞表面分子)為標記,利用流式細胞術對各組巨噬細胞的M1/M2極化狀態(tài)進行檢測。(5)分別取A、B、C、D組培養(yǎng)上清液對小鼠皮膚成纖維細胞進行培養(yǎng),利用CCK8試劑盒對A、B、C、D組成纖維細胞進行增殖率檢測,并繪制生長曲線。分別于培養(yǎng)3d和5d兩個時間點收集細胞,利用qPCR和Western blot對TGF-β1、I型膠原、III型膠原mRNA表達情況及蛋白含量進行檢測。結果:(1)利用胰蛋白酶-膠原酶兩歩消化法可獲得大量原代hAMSCs,經(jīng)過差速貼壁法可獲得大量高純度hAMSCs,原代細胞形態(tài)多樣,呈紡錘狀多突起,短梭形或多角形,排列紊亂,纖維樣生長。經(jīng)過傳代培養(yǎng)后形態(tài)呈長梭形或紡錘狀,旋渦狀生長,具有方向性。P3代羊膜間充質干細胞(hAMSCs)流式細胞術鑒定結果提示:CD105(98.58%)、CD73(99.54%)、CD44(96.23%)、CD90(96.88%),呈陽性。IL-10-hAMSCs流式細胞術鑒定結果:CD105(96.67%)、CD73(99.67%)、CD44(95.20%)、CD90(98.50%),呈陽性。兩種細胞CD34+11b、+19+45+HLA-DR均呈陰性表達。免疫熒光提示Vimentin在hAMSCs中高表達,而不表達CK19。(2)慢病毒感染P3代hAMSCs細胞,經(jīng)72h后于倒置熒光顯微鏡下觀察,IL-10慢病毒及空質粒感染hAMSCs均表達均勻的綠色熒光,病毒感染效率可達到90%。CCK8法繪制生長曲線提示:hAMSCs、空質粒-hAMSCs細胞及IL-10-hAMSCs在經(jīng)歷了1~2天緩慢生長以后,在3~6天進入對數(shù)生長期,第6天進入平臺期,曲線呈現(xiàn)“S”形,轉染后的細胞增殖能力略有下降。(3)經(jīng)過酶消化法成功獲取大量的成纖維細胞,體外快速貼壁生長,原代細胞呈現(xiàn)短棒狀、長梭形、多角形及不規(guī)則形狀。Vimentin免疫熒光提示獲取了較高純度的成纖維細胞。巨噬細胞呈橢圓形、短梭形及不規(guī)則形態(tài)等,墨汁吞噬實驗陽性,吞噬百分率可達89%。(4)hAMSCs及巨噬細胞共培養(yǎng)后流式細胞術分析結果:0天各組均以M1型巨噬細胞表面標記為主,A、B、C、D組M1型細胞百分比為98.20%、99.20%、97.90%、97.20%;第1天各組表型開始變化,A、B、C、D組M1表型百分比95.20%、79%、64.20%、78.50%,其中以C組M1型細胞比例減少最為明顯;第3天M1型細胞所占比例:A、B、C、D組分別為90.70%、57.20%、11.20%、55.80%,C組M1型巨噬細胞較第1天M1型比例明顯減少,88%轉化為M2型巨噬細胞。(5)ELISA法檢測0d、1d、3d空白對照組共培養(yǎng)上清液中IL-12含量為:474.840±2.978pg/mL、304.415±3.747pg/m L、325.938±12.229pg/mL;hAMSCs組上清液中IL-12含量:473.709±49.485pg/mL、235.248±1.329pg/mL、183.395±11.268pg/mL;IL-10-hAMSCs組IL-12含量:413.131±37.422pg/mL、199.429±0.319pg/mL、138.084±1.491pg/mL;空質粒-hAMSCs組上清液中IL-12含量為:421.935±73.823pg/mL、246.828±11.680pg/mL、185.869±8.570pg/mL;空白對照組上清液中IL-10含量:12.265±0.271pg/mL、17.111±1.244pg/m L、30.106±1.181pg/mL;hAMSCs組上清液中IL-10含量:16.800±2.585pg/mL、35.907±2.155pg/mL、89.128±4.872pg/mL;IL-10-hAMSCs組IL-10含量:13.515±0.716pg/mL、77.906±1.849pg/mL、258.012±5.784pg/mL;空質粒-hAMSCs組上清液中IL-10含量為:13.046±1.180pg/mL、35.593±3.467pg/mL、98.469±3.056pg/mL;空白對照組上清液中Arg-1含量:0.730±0.060ng/mL、0.925±0.083ng/mL、1.137±0.037ng/mL;hAMSCs組上清液中Arg-1含量:0.783±0.033ng/mL、2.342±0.063ng/mL、4.671±0.094ng/mL;IL-10-hAMSCs組Arg-1含量:0.820±0.035ng/mL、5.112±0.191ng/mL、10.920±0.959ng/mL;空質粒-hAMSCs組上清液中Arg-1含量為:0.802±0.046ng/mL、2.588±0.372ng/mL、4.995±0.453ng/mL;結果顯示上清液中Arg-1及IL-10含量隨著培養(yǎng)時間延長含量逐漸增加,且hAMSCs組、空質粒-hAMSCs組、IL-10-hAMSCs組的Arg-1、IL-10表達量在1、3天相對于對照組高,IL-10-hAMSCs組相對于hAMSCs組、空質粒-hAMSCs組表達量高,并且IL-10-hAMSCs組表達量升高尤為明顯。IL-12表達隨著共培養(yǎng)時間延長含量逐漸降低,hAMSCs組、空質粒-hAMSCs組、IL-10-hAMSCs組含量較對照組降低,IL-10-hAMSCs組的IL-12含量較hAMSCs組、空質粒-hAMSCs組降低更為明顯,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05)。(6)取各組生長狀態(tài)良好的成纖維細胞利用CCK8試劑盒進行細胞增殖速率檢測,四組成纖維細胞生長曲線均呈現(xiàn)“S”型,IL-10-hAMSCs組成纖維細胞增殖速率明顯快于其他三組,hAMSCs組和空質粒-hAMSCs組的成纖維細胞增殖速率快于空白對照組,差異具有統(tǒng)計學意義(P0.05)。(7)qPCR檢測出TGF-β1、I型膠原、III型膠原基因相對于β-actin基因表達量,各組上清液培養(yǎng)的成纖維細胞,隨著培養(yǎng)時間延長,TGF-β1、I型膠原、III型膠原mRNA相對表達量逐漸增加,同一時間點hAMSCs組、空質粒-hAMSCs組、IL-10-hAMSCs組TGF-β1、I型膠原、III型膠原mRNA相對表達量均高于對照組,并且IL-10-hAMSCs組相對于hAMSCs組、空質粒組相對表達量更高,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05)。hAMSCs組與空質粒-hAMSCs組相比較未見明顯差異(P0.05)。通過Western blot檢測結果顯示:在第3d和5d,hAMSCs組、空質粒-hAMSCs組、IL-10-hAMSCs組的TGF-β1、I型膠原、III型膠原蛋白表達量隨著培養(yǎng)時間延長逐漸增加,同一時間點hAMSCs組、空質粒-hAMSCs組、IL-10-hAMSCs組TGF-β1、I型膠原、III型膠原蛋白表達量均高于空白對照組,IL-10-hAMSCs組相對于hAMSCs組、空質粒-hAMSCs組相對表達量更高,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05)。hAMSCs組與空質粒-hAMSCs組相比較未見明顯差異(P0.05)。結論:1.與hAMSCs相比IL-10-hAMSCs能夠在體外促進巨噬細胞由促炎表型M1型向組織修復型M2型轉化。2.IL-10-hAMSCs與巨噬細胞共培養(yǎng)上清液能夠促進成纖維細胞增殖,并上調成纖維細胞TGF-β1、I型及III型膠原的表達,有利于促進創(chuàng)面早期愈合。
【學位單位】：遵義醫(yī)學院
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2018
【中圖分類】：R64
【部分圖文】：

37 ℃細胞培養(yǎng)箱中孵育 4h，4h 后每孔加入 2ml PB顆粒 3 次，顯微鏡下觀察計數(shù) 100 個巨噬細胞，計算巨噬細胞胞漿中吞有大小墨粒 5 個以上的為陽性細胞，吞噬百分率=陽胞×100%。腔巨噬細胞與 hAMSCs 分組共培養(yǎng)為：A 組：空白對照組（單純添加培養(yǎng)基）+小鼠腹腔巨噬細s+小鼠腹腔巨噬細胞組；C 組：IL-10-hAMSCs+小鼠腹腔巨噬細hAMSCs+小鼠腹腔巨噬細胞組；小鼠腹腔巨噬細胞培養(yǎng) 3~4 天 M1 型，移除 6 孔板內含 IFN-γ及 LPS 的 DMEM/F12 培養(yǎng)基胞及培養(yǎng)基于 Transwell 小室上層（圖 1），加入 DMEM/F12 5％CO2、37 ℃飽和濕度的細胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。培養(yǎng) 0d后期 ELISA 指標檢測，同時收集相應時間點的細胞進行后期

遵義醫(yī)學院碩士學位論文 岳鳳3 結果3.1 hAMSCs 形態(tài)及生長特點原代細胞細胞接種 48h 后，hAMSCs 大部分已貼壁，形態(tài)多樣，呈紡錘狀多突起短梭形或多角形，排列紊亂，成纖維細胞樣生長。培養(yǎng)至第 5～6 天時，貼壁細胞合至 90%以上。傳代后 24 小時基本貼壁，大多呈長梭形，少數(shù)呈現(xiàn)短棒狀，相互聯(lián)，3~5 天細胞密度可達 80%～90%，形態(tài)呈長梭形或紡錘狀，旋渦狀生長，具有向性。3~5 天更新一代，隨著傳代次數(shù)增加，細胞生長速度逐漸變慢，部分細胞肥大內部可見空泡，且出現(xiàn)偽足（圖 2）。

流式細胞術hAMSCs表型鑒定
【參考文獻】

相關期刊論文 前10條

1 周善宇;張龍宵;高美華;高學軍;路超;吳利;李坤;熊樂;蔡霞;;姜黃素對創(chuàng)面愈合作用的影響及其機制的初步探討[J];國際免疫學雜志;2017年02期

2 周歲鋒;;眼鏡蛇傷潰瘍創(chuàng)面炎癥細胞趨化及血管內皮因子表達的臨床研究[J];世界中西醫(yī)結合雜志;2015年09期

3 余功旺;黃文浩;劉愛梅;孫艷;;小鼠腹腔巨噬細胞炎癥模型的建立[J];廣東藥學院學報;2014年06期

4 嚴龍宗;陳斌;;慢性創(chuàng)面愈合的細胞治療[J];中國組織工程研究;2013年46期

5 杜啟翠;肖文林;孫桂蘭;馬秀興;姚如永;;原代培養(yǎng)人增生性瘢痕成纖維細胞的生物學行為[J];中國組織工程研究;2013年07期

6 孫亞如;張美榮;高宏;;干細胞分泌因子促進難愈性創(chuàng)面愈合的機制及應用前景[J];中國組織工程研究;2012年06期

7 繆明遠;牛軼雯;陸樹良;;巨噬細胞活化與創(chuàng)面愈合[J];上海交通大學學報(醫(yī)學版);2011年08期

8 周春清;姜紅;許峰;;血小板生長因子對新生鼠缺血缺氧性腦損傷保護作用[J];青島大學醫(yī)學院學報;2010年05期

9 夏鵬;童文祥;喻永敏;李剛蓮;馬智華;楊里;萬立華;;大鼠皮膚切創(chuàng)愈合過程中VEGF,TGF-β1蛋白的表達[J];重慶醫(yī)科大學學報;2010年08期

10 李康;郭強;王翠妮;陳敏;徐薇;熊思東;;M1和M2型巨噬細胞表型的比較分析[J];現(xiàn)代免疫學;2008年03期

本文編號：2860575