背景:器官移植是解決多種器官終末期疾病的最佳選擇,而移植耐受也是移植領(lǐng)域工作者的一大研究方向。近年來,各種研究表明小分子抑制劑JQ1在各個領(lǐng)域都有重要作用,尤其是在抑制炎癥反應(yīng)方面。然而目前尚未有關(guān)于JQ1在移植領(lǐng)域的研究。自噬作為細(xì)胞降解不必要的底物包括受損的細(xì)胞器、錯誤折疊蛋白和病原體等的過程,對維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)有著重要的生理學(xué)意義,并且與炎癥有密切的關(guān)系。實(shí)驗(yàn)?zāi)康?探究小分子化合物JQ1是否具有延長移植心臟存活的作用。并且進(jìn)一步分析JQ1對心肌細(xì)胞,各種炎癥相關(guān)因子以及免疫細(xì)胞的影響,以進(jìn)一步研究其機(jī)制。材料與方法:將野生型C57BL/6小鼠隨機(jī)分成兩組作為心臟供體,以Balb/c小鼠作為受體,建立同種異基因異位心臟移植模型,移植后兩組分別注射對照溶液,JQ1溶液。一部分小鼠用于觀察移植后心臟的存活時間,其余小鼠于術(shù)后3、5、7天分別安樂處死,取移植心臟樣本做蘇木精—伊紅染色(HE)染色觀察組織結(jié)構(gòu)及炎癥浸潤情況,細(xì)胞因子微球檢測技術(shù)檢測供體心臟中的炎癥相關(guān)的細(xì)胞因子表達(dá)情況,Western Blot檢測自噬通路上各蛋白變化,透射電鏡觀察心肌細(xì)胞中自噬小體的數(shù)量,并用流式細(xì)胞技術(shù)檢測兩組中主要免疫細(xì)胞的變化。之后通過Baflomycin A1(BafA1)阻斷自噬、他莫昔芬誘導(dǎo)的Cre/loxP重組酶系統(tǒng)構(gòu)建的心肌特異性ATG5基因敲除小鼠證明JQ1通過自噬通路影響移植心臟的存活時間。結(jié)果:研究表明,JQ1能夠有效的延長移植后心臟的存活時間。HE染色顯示,術(shù)后第7天,J Q1組小鼠心臟組織完整性較對照組好,且炎癥細(xì)胞浸潤明顯減少。Western Blot實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),JQ1組的LKB1水平明顯上調(diào),AMPK激酶的磷酸化水平、ULK1磷酸化水平、ATG14磷酸化水平、ATG5-ATG12復(fù)合物水平以及LC3Ⅱ明顯升高。與之一致的是,電鏡下觀察發(fā)現(xiàn),JQ1組自噬小體明顯多于對照組。BafA1與JQ1聯(lián)用組相比于JQ1單用組,存活時間明顯下降,接近于對照組水平。同時,我們發(fā)現(xiàn)供體心肌細(xì)胞中ATG5特異性敲除后,使用JQ1處理,存活時間較JQ1單用組下降,接近對照組。同時,JQ1組心肌組織中IL-1β,IL-2,IL-6,TNF-α,IFN-γ,IL-17等炎癥因子在術(shù)后3、5、7天時相比于對照組均有不同程度的下降。并且,在阻斷自噬之后再使用JQ1,IL-1β,IL-6,TNF-α,IFN-γ的水平較JQ1單用組升高明顯。此外,我們發(fā)現(xiàn),JQ1組較對照組,脾臟中Treg水平下降,而外周血、心肌組織浸潤的Treg水平不變,而在體外實(shí)驗(yàn)中,JQ1組處理的Th1,Th2,Th17及Treg細(xì)胞的增值分化水平明顯低于對照組。JQ1組與對照組脾臟中CD4+CD69+與CD8+CD69+T細(xì)胞水平?jīng)]有明顯變化。結(jié)論:JQ1能夠顯著延長移植后小鼠移植心臟的存活時間,機(jī)制為JQ1通過LKB1-AMPK-ULK1通路,促進(jìn)自噬,從而抑制炎癥,使移植心臟存活時間延長。
【學(xué)位單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R654.2
【部分圖文】：

浙江大學(xué)碩士學(xué)位論文邐逡逑３結(jié)果逡逑３．１邋ＪＱ１能夠延長移植心臟的存活時間逡逑從移植術(shù)后開始，ＪＱ１組小鼠每天腹腔注射配置好的ＪＱ１溶液（劑量：逡逑２５ｍｇ／ｋｇ）至第七天，對照組則注射相同劑量的對照溶液。每天觀察及觸摸頸逡逑部心臟的跳動情況并記錄。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，Ｂａｌｂ／ｃ—Ｂａｌｂ／ｃ組小鼠可以無限存逡逑活，說明手術(shù)操作沒有問題。ＪＱ１組小鼠的平均存活時間為（１９．１４邋士邋４．５８）天，逡逑相比于對照組的（８．２５邋士邋０．９７）天顯著延長了，并且兩組比較存在統(tǒng)計學(xué)意義逡逑（圖１Ａ）。之后，取移植術(shù)后第７天的心臟標(biāo)本，ＨＥ染色，鏡下觀察可見：逡逑ＪＱ１組小鼠移植心臟組織結(jié)構(gòu)相對完整，炎癥細(xì)胞浸潤也較少，而對照組移植逡逑心臟中，組織結(jié)構(gòu)破壞明顯，同時有大量的炎癥細(xì)胞浸潤（圖１Ｂ）。說明，ＪＱ１逡逑在移植術(shù)后對心臟的組織結(jié)構(gòu)具有保護(hù)作用。逡逑

的方法檢測了移植心臟中細(xì)胞自噬的水平。首先，我們做了蛋白質(zhì)印跡（ｗｅｓｔｅｒｎ逡逑ｂｌｏｔ），發(fā)現(xiàn)心肌組織中自噬相關(guān)蛋白ＡＴＧ５－ＡＴＧ１２復(fù)合物與ＬＣ３ＩＩ在ＪＱ１組明顯逡逑高于對照組（圖２Ａ）。此外，我們在透射電鏡下觀察到，ＪＱ１組的自噬小體數(shù)量明逡逑顯多于對照組，且有明顯的統(tǒng)計學(xué)差異（Ｐ＜0．000ｌ）（圖２Ｂ，２Ｄ），結(jié)合ｗｅｓｔｅｍｂｌｏｔ逡逑的數(shù)據(jù)，我們可以得出，ＪＱ１促進(jìn)了心肌細(xì)胞的自噬。為了驗(yàn)證在移植之后，心肌逡逑細(xì)胞的自噬被誘導(dǎo)，我們?nèi)×宋匆浦驳男呐K組織做空白對照，發(fā)現(xiàn)對照組相比于逡逑空白組，心肌細(xì)胞中自噬小體增多，這說明了移植之后，自噬較基礎(chǔ)水平增加。逡逑此外，我們意外的發(fā)現(xiàn)，心肌組織中，ＪＱ１組ＬＫＢ１的ｍＲＮＡ水平與對照組逡逑相比明顯升高，并且有顯著的統(tǒng)計學(xué)差異（ｐ＝0．00６１）（圖２Ｃ）。隨后我們用ｗｅｓｔｅｒｎ逡逑ｂｌｏｔ的方法，檢測了邋ＬＫＢ１的蛋白水平變化，發(fā)現(xiàn)結(jié)果與ＲＴ－ＰＣＲ的結(jié)果一致，ＪＱ１逡逑組的ＬＫＢ１明顯多于對照組。ＬＫＢ１作為ＡＭＰＫ上游的重要激酶

植心臟存活的作用。結(jié)果顯示，ＢａｆＡｌ單用組相比于對照組存活時間縮短，說明逡逑抑制自噬能夠縮短存活時間，而ＪＱｌ＋ＢａｆＡｌ組與ＪＱ１組比較，存活曲線明顯縮短，逡逑接近對照組水平但仍稍高于對照組（圖３Ａ）。這說明，自噬被藥物全身性阻斷后，逡逑ＪＱ１的作用大大減弱，甚至消失。逡逑Ａ逡逑１００－１邐ｐ－｜邐１邐ｏ逡逑Ｉ邋８０－邋＂Ｕ邐＋邋ＪＱ１（ｎ＝７）邐ｔ逡逑１邐６０－邋＇ｈ邋Ｔ邋１邐Ｃ�！福╁澹赍�、逡逑ｓ邋４０－邐ｈ邐＋邋ＪＱ１＋ＢａｆＡ１（ｎ＝７）逡逑備邐Ｌ邐１邐邋令邋Ｂａｌｂ／ｃ（ｎ＝６）逡逑２０－邋ｉｎ逡逑邐１￣%跡

本文編號：2831425