背景:器官移植是解決多種器官終末期疾病的最佳選擇,而移植耐受也是移植領域工作者的一大研究方向。近年來,各種研究表明小分子抑制劑JQ1在各個領域都有重要作用,尤其是在抑制炎癥反應方面。然而目前尚未有關于JQ1在移植領域的研究。自噬作為細胞降解不必要的底物包括受損的細胞器、錯誤折疊蛋白和病原體等的過程,對維持細胞穩(wěn)態(tài)有著重要的生理學意義,并且與炎癥有密切的關系。實驗目的:探究小分子化合物JQ1是否具有延長移植心臟存活的作用。并且進一步分析JQ1對心肌細胞,各種炎癥相關因子以及免疫細胞的影響,以進一步研究其機制。材料與方法:將野生型C57BL/6小鼠隨機分成兩組作為心臟供體,以Balb/c小鼠作為受體,建立同種異基因異位心臟移植模型,移植后兩組分別注射對照溶液,JQ1溶液。一部分小鼠用于觀察移植后心臟的存活時間,其余小鼠于術后3、5、7天分別安樂處死,取移植心臟樣本做蘇木精—伊紅染色(HE)染色觀察組織結構及炎癥浸潤情況,細胞因子微球檢測技術檢測供體心臟中的炎癥相關的細胞因子表達情況,Western Blot檢測自噬通路上各蛋白變化,透射電鏡觀察心肌細胞中自噬小體的數(shù)量,并用流式細胞技術檢測兩組中主要免疫細胞的變化。之后通過Baflomycin A1(BafA1)阻斷自噬、他莫昔芬誘導的Cre/loxP重組酶系統(tǒng)構建的心肌特異性ATG5基因敲除小鼠證明JQ1通過自噬通路影響移植心臟的存活時間。結果:研究表明,JQ1能夠有效的延長移植后心臟的存活時間。HE染色顯示,術后第7天,J Q1組小鼠心臟組織完整性較對照組好,且炎癥細胞浸潤明顯減少。Western Blot實驗發(fā)現(xiàn),JQ1組的LKB1水平明顯上調,AMPK激酶的磷酸化水平、ULK1磷酸化水平、ATG14磷酸化水平、ATG5-ATG12復合物水平以及LC3Ⅱ明顯升高。與之一致的是,電鏡下觀察發(fā)現(xiàn),JQ1組自噬小體明顯多于對照組。BafA1與JQ1聯(lián)用組相比于JQ1單用組,存活時間明顯下降,接近于對照組水平。同時,我們發(fā)現(xiàn)供體心肌細胞中ATG5特異性敲除后,使用JQ1處理,存活時間較JQ1單用組下降,接近對照組。同時,JQ1組心肌組織中IL-1β,IL-2,IL-6,TNF-α,IFN-γ,IL-17等炎癥因子在術后3、5、7天時相比于對照組均有不同程度的下降。并且,在阻斷自噬之后再使用JQ1,IL-1β,IL-6,TNF-α,IFN-γ的水平較JQ1單用組升高明顯。此外,我們發(fā)現(xiàn),JQ1組較對照組,脾臟中Treg水平下降,而外周血、心肌組織浸潤的Treg水平不變,而在體外實驗中,JQ1組處理的Th1,Th2,Th17及Treg細胞的增值分化水平明顯低于對照組。JQ1組與對照組脾臟中CD4+CD69+與CD8+CD69+T細胞水平沒有明顯變化。結論:JQ1能夠顯著延長移植后小鼠移植心臟的存活時間,機制為JQ1通過LKB1-AMPK-ULK1通路,促進自噬,從而抑制炎癥,使移植心臟存活時間延長。
【學位單位】：浙江大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2018
【中圖分類】：R654.2
【部分圖文】：

浙江大學碩士學位論文邐逡逑３結果逡逑３．１邋ＪＱ１能夠延長移植心臟的存活時間逡逑從移植術后開始，ＪＱ１組小鼠每天腹腔注射配置好的ＪＱ１溶液（劑量：逡逑２５ｍｇ／ｋｇ）至第七天，對照組則注射相同劑量的對照溶液。每天觀察及觸摸頸逡逑部心臟的跳動情況并記錄。實驗結果顯示，Ｂａｌｂ／ｃ—Ｂａｌｂ／ｃ組小鼠可以無限存逡逑活，說明手術操作沒有問題。ＪＱ１組小鼠的平均存活時間為（１９．１４邋士邋４．５８）天，逡逑相比于對照組的（８．２５邋士邋０．９７）天顯著延長了，并且兩組比較存在統(tǒng)計學意義逡逑（圖１Ａ）。之后，取移植術后第７天的心臟標本，ＨＥ染色，鏡下觀察可見：逡逑ＪＱ１組小鼠移植心臟組織結構相對完整，炎癥細胞浸潤也較少，而對照組移植逡逑心臟中，組織結構破壞明顯，同時有大量的炎癥細胞浸潤（圖１Ｂ）。說明，ＪＱ１逡逑在移植術后對心臟的組織結構具有保護作用。逡逑

的方法檢測了移植心臟中細胞自噬的水平。首先，我們做了蛋白質印跡（ｗｅｓｔｅｒｎ逡逑ｂｌｏｔ），發(fā)現(xiàn)心肌組織中自噬相關蛋白ＡＴＧ５－ＡＴＧ１２復合物與ＬＣ３ＩＩ在ＪＱ１組明顯逡逑高于對照組（圖２Ａ）。此外，我們在透射電鏡下觀察到，ＪＱ１組的自噬小體數(shù)量明逡逑顯多于對照組，且有明顯的統(tǒng)計學差異（Ｐ＜0．000ｌ）（圖２Ｂ，２Ｄ），結合ｗｅｓｔｅｍｂｌｏｔ逡逑的數(shù)據(jù)，我們可以得出，ＪＱ１促進了心肌細胞的自噬。為了驗證在移植之后，心肌逡逑細胞的自噬被誘導，我們取了未移植的心臟組織做空白對照，發(fā)現(xiàn)對照組相比于逡逑空白組，心肌細胞中自噬小體增多，這說明了移植之后，自噬較基礎水平增加。逡逑此外，我們意外的發(fā)現(xiàn)，心肌組織中，ＪＱ１組ＬＫＢ１的ｍＲＮＡ水平與對照組逡逑相比明顯升高，并且有顯著的統(tǒng)計學差異（ｐ＝0．00６１）（圖２Ｃ）。隨后我們用ｗｅｓｔｅｒｎ逡逑ｂｌｏｔ的方法，檢測了邋ＬＫＢ１的蛋白水平變化，發(fā)現(xiàn)結果與ＲＴ－ＰＣＲ的結果一致，ＪＱ１逡逑組的ＬＫＢ１明顯多于對照組。ＬＫＢ１作為ＡＭＰＫ上游的重要激酶

植心臟存活的作用。結果顯示，ＢａｆＡｌ單用組相比于對照組存活時間縮短，說明逡逑抑制自噬能夠縮短存活時間，而ＪＱｌ＋ＢａｆＡｌ組與ＪＱ１組比較，存活曲線明顯縮短，逡逑接近對照組水平但仍稍高于對照組（圖３Ａ）。這說明，自噬被藥物全身性阻斷后，逡逑ＪＱ１的作用大大減弱，甚至消失。逡逑Ａ逡逑１００－１邐ｐ－｜邐１邐ｏ逡逑Ｉ邋８０－邋＂Ｕ邐＋邋ＪＱ１（ｎ＝７）邐ｔ逡逑１邐６０－邋＇ｈ邋Ｔ邋１邐Ｃ�！福╁澹赍�、逡逑ｓ邋４０－邐ｈ邐＋邋ＪＱ１＋ＢａｆＡ１（ｎ＝７）逡逑備邐Ｌ邐１邐邋令邋Ｂａｌｂ／ｃ（ｎ＝６）逡逑２０－邋ｉｎ逡逑邐１￣%跡

本文編號：2831425