目的:通過建立一種低溫糖氧剝奪/再灌注(oxygen-glucose deprivation/reoxygenation,OGD/R)HT22細(xì)胞模型來模擬深低溫停循環(huán)(deep hypothermic circulatory arrest,DHCA)誘導(dǎo)的腦細(xì)胞損傷,從而探究氫氣對損傷HT22細(xì)胞內(nèi)miR-29家族的調(diào)控作用,進(jìn)一步研究miR-29家族在低溫OGD/R相關(guān)性腦細(xì)胞損傷上的效應(yīng)和相關(guān)機(jī)制。方法:將HT22細(xì)胞隨機(jī)分為10組:(1)對照組;(2)低溫OGD/R組;(3)低溫OGD/R+氫氣組;(4)miR-NC組;(5)agomiR-29a/b/c組(5-7);(6)antamiR-29a/b/c組(8-10)。運(yùn)用一個(gè)密閉容器和一個(gè)厭氧產(chǎn)氣袋建立低溫OGD/R模型;定量PCR檢測各組HT22細(xì)胞內(nèi)miR-29家族的表達(dá);CCK-8試劑盒檢測細(xì)胞活性;western blot檢測HT22細(xì)胞內(nèi)KEAP1、NRF2、BAX和PUMA蛋白含量;JC-1和H2DCFDA試劑盒分別測定HT22細(xì)胞內(nèi)活性氧(reactive oxygen species,ROS)含量和線粒體膜電位(mitochondrial membrane potential,MMP);雙熒光素酶報(bào)告分析實(shí)驗(yàn)來驗(yàn)證miR-29家族的下游作用靶點(diǎn)。結(jié)果:我們發(fā)現(xiàn)氫氣能夠顯著增加OGD/R相關(guān)性HT22細(xì)胞內(nèi)miR-29家族的表達(dá);將miR-29家族類似物轉(zhuǎn)染至受損HT22細(xì)胞后,腦細(xì)胞損傷顯著減輕:活細(xì)胞數(shù)目增加,ROS含量減少,MMP下降減輕,氧化應(yīng)激相關(guān)蛋白KEAP1和凋亡相關(guān)蛋白PUMA、BAX表達(dá)下降,抗氧化應(yīng)激相關(guān)蛋白NRF2表達(dá)增加;雙熒光素酶報(bào)告分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明miR-29家族能夠直接靶定促凋亡蛋白PUMA,并抑制其表達(dá)。結(jié)論:氫氣的腦細(xì)胞保護(hù)效應(yīng)與其能夠上調(diào)miR-29家族的表達(dá)密切相關(guān),且miR-29家族可以通過作用于一種促凋亡BCL-2家族成員-PUMA,從而對DHCA介導(dǎo)的神經(jīng)元損傷產(chǎn)生保護(hù)性作用。目的:探究富氫鹽水(hydrogen rich saline,HRS)對DHCA大鼠海馬組織內(nèi)miR-29家族的調(diào)控作用;進(jìn)一步研究miR-29家族類似物對DHCA大鼠腦損傷的效應(yīng)和相關(guān)機(jī)制。方法:運(yùn)用改良Pulsineli四血管阻斷法來建立DHCA大鼠模型;通過微量注射器和立體定位儀將miR-29家族合成物注射到大鼠海馬組織中;運(yùn)用定量PCR法來檢測各組海馬組織中miR-29家族的表達(dá)量;運(yùn)用組織病理學(xué)方法來觀察DHCA相關(guān)性海馬神經(jīng)元的形態(tài)特征;運(yùn)用特定試劑盒來測定大鼠海馬組織和血清中相關(guān)炎性因子和氧化因子含量,western blot檢測海馬組織中Caspase-3,BAX,PUMA,KEAP1和NRF2蛋白的表達(dá)。結(jié)果:HRS能夠顯著上調(diào)DHCA大鼠海馬組織內(nèi)的miR-29家族表達(dá);在大鼠海馬組織中注入miR-29家族合成物后,DHCA大鼠腦損傷顯著減輕:海馬細(xì)胞凋亡減少,海馬CA1區(qū)細(xì)胞組織病理學(xué)特征改善,海馬組織和血清中MDA含量和NOS活性下降,SOD活性增加,炎性因子TNF-α以及IL-1β含量降低,抗炎因子IL-10含量增加,氧化應(yīng)激相關(guān)蛋白KEAP1和凋亡相關(guān)蛋白Caspase-3、PUMA、BAX表達(dá)下降,抗氧化應(yīng)激相關(guān)蛋白NRF2表達(dá)增加。結(jié)論:富氫鹽水在DHCA大鼠中的腦保護(hù)效應(yīng)與其能夠上調(diào)miR-29家族的表達(dá)密切相關(guān),且miR-29家族能夠通過抗凋亡,抗炎和抗氧化作用來發(fā)揮保護(hù)性效應(yīng)。
【學(xué)位單位】：上海交通大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R61
【部分圖文】：

OGD6h/R6h/12h/24h 培養(yǎng)后，細(xì)胞開始出現(xiàn)大量凋亡形態(tài)，其中 OGD6h/R6h 最適合后續(xù)干預(yù)處理。圖1 不同再灌注條件下HT22細(xì)胞的典型形態(tài)學(xué)圖像。

上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院2.2 氫氣可以顯著抑制低溫糖氧剝奪/再灌注（OGD/R）誘導(dǎo)的 HT22細(xì)胞中的 miR-29 家族表達(dá)下降首先將 HT22 細(xì)胞進(jìn)行低溫 OGD 處理 6 小時(shí)，然后恢復(fù)正常培養(yǎng) 3 小時(shí)/6 小時(shí)/18 小時(shí)即R3h/6h/18h。運(yùn)用實(shí)時(shí)定量 PCR 的方法檢測各個(gè)組別細(xì)胞中的 miR-29a/b/c 表達(dá)量，發(fā)現(xiàn)隨著再灌注時(shí)間的延長，miR-29 家族表達(dá)量逐步降低（圖 2A）。但是當(dāng)用 75%氫氣處理損OGD6h/R6h 誘導(dǎo)的 HT22 細(xì)胞時(shí)，miR-29 家族的表達(dá)顯著上調(diào)（圖 2B）。

21圖 3 miR-29a/b/c 對照劑、類似物和抑制劑在低溫 OGD6h/R6h 相關(guān)性 HT22 細(xì)胞增殖上的效應(yīng)。A 在轉(zhuǎn)染 miR-29 家族合成物 48 小時(shí)后，HT22 細(xì)胞接受低溫 OGD6h/R6h 處理所顯示出的典型形態(tài)學(xué)變化。B 各組 HT22 細(xì)胞在 450nm 波長下的熒光值柱狀統(tǒng)計(jì)圖。比例尺 100μm。N=6; **, p<0.01。

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2827971