創(chuàng)傷性腦損傷(TBI)的致殘、致死率居各類創(chuàng)傷之首。近年來,隨著臨床神經(jīng)學(xué)科對TBI救治水平的提高,患者生存時間顯著延長,但仍有很大一部分TBI患者終身遺留不同程度的神經(jīng)功能殘疾或認(rèn)知功能障礙,給個人、家庭和社會造成了沉重的負(fù)擔(dān)。因此,深入研究TBI后神經(jīng)再生修復(fù),尋求合理可行的干預(yù)策略,改善TBI的預(yù)后,是亟待解決的重要科學(xué)問題。NSCs作為修復(fù)腦損傷的核心效應(yīng)細(xì)胞,具有分裂增殖、多方向分化、主動趨向移行等生物功能。海馬區(qū)作為CNS內(nèi)源性NSCs的“巢區(qū)”,存在自主修復(fù)腦損傷的機(jī)制。在TBI損傷發(fā)生后,“巢區(qū)”內(nèi)的NSCs被激活,通過增殖、分化、遷移、整合等過程,啟動再生修復(fù),建立新突觸結(jié)構(gòu),修復(fù)TBI造成的神經(jīng)功能缺失。然而,在TBI后的腦內(nèi)復(fù)雜病理環(huán)境中,NSCs的自主再生修復(fù)能力十分有限,不足以彌補(bǔ)TBI造成的腦組織結(jié)構(gòu)破壞和神經(jīng)功能損害。因此,研究TBI后病理環(huán)境中制約NSCs再生潛能的瓶頸因素,闡明這些制約因素的深層調(diào)控作用機(jī)制,從根本上提升NSCs的再生能力、促進(jìn)受損的神經(jīng)功能重建,是改善TBI預(yù)后與轉(zhuǎn)歸的重要途徑。TBI后影響腦內(nèi)NSCs修復(fù)能力的因素繁多,其中,炎性反應(yīng)伴隨TBI損傷與修復(fù)的全過程,炎性反應(yīng)一方面加重神經(jīng)細(xì)胞的損傷,引起更為嚴(yán)重的腦功能損害,另一方面激活NSCs分裂增殖、多向分化,啟動再生與修復(fù)。因此,深入研究TBI后調(diào)控炎癥反應(yīng)的信號分子與相關(guān)機(jī)制,對提升TBI后NSCs再生修復(fù)潛能意義重大。TLR4作為TLRs家族中發(fā)現(xiàn)最早的模式識別受體之一,通過識別外源侵入的病理相關(guān)分子模式,以及腦損傷后細(xì)胞釋放的內(nèi)源性損傷相關(guān)分子模式,活化下游Myd88和TRIF介導(dǎo)的兩路信號途徑,調(diào)控炎癥反應(yīng)發(fā)生發(fā)展。關(guān)于CNS的TLR4功能,早年多集中在其與膠質(zhì)細(xì)胞介導(dǎo)的“瀑布式”炎癥反應(yīng)關(guān)系,后來逐漸關(guān)注到TLR4在神經(jīng)元損傷轉(zhuǎn)歸中的作用。新近研究提示:體外培養(yǎng)的NSCs膜表面也可能存在TLR4,且可能影響NSCs增殖、分化等生物特性。然而,有關(guān)TBI后炎性環(huán)境中TLR4與內(nèi)源性NSCs功能的研究,目前尚未見報道。因此,本課題基于TBI后神經(jīng)再生困難這一難題,以海馬區(qū)NSCs為核心,以TLR4為切入點(diǎn),深入研究TBI后TLR4信號途徑對NSCs再生修復(fù)的調(diào)控作用與相關(guān)機(jī)制,不僅是從全新的角度認(rèn)識腦損傷后中樞再生與修復(fù),也將可能為NSCs臨床轉(zhuǎn)化研究提供新的理論基礎(chǔ)。研究目的本研究分別從體內(nèi)、體外層面,探討TBI后神經(jīng)再生環(huán)境中海馬組織TLR4的時空分布特征與表達(dá)意義,研究TBI后TLR4表達(dá)變化對NSCs增殖分化的影響作用,闡明TBI后TLR4信號通路調(diào)控NSCs再生修復(fù)的具體機(jī)制。研究方法本研究在穩(wěn)定的C57BL/6小鼠TBI模型建立和體外NSCs培養(yǎng)基礎(chǔ)上,采用免疫熒光共標(biāo)染色、蛋白印跡、RT-PCR等方法,檢測TBI后海馬區(qū)TLR4的細(xì)胞定位與表達(dá)水平,分析TLR4表達(dá)與NSCs增殖之間的潛在聯(lián)系。在此基礎(chǔ)上,采用TLR4基因缺失小鼠和TLR4藥理學(xué)抑制/激動劑干預(yù),通過體內(nèi)、體外免疫熒光多重染色、CCK-8分析、蛋白印跡、透射電鏡、激光共聚焦顯微鏡觀察等方法,分析TBI后TLR4表達(dá)變化對NSCs增殖能力、分化轉(zhuǎn)歸的影響作用。進(jìn)一步采用藥理學(xué)抑制劑與siRNA技術(shù),體內(nèi)、體外調(diào)控TLR4下游Myd88與TRIF途徑的關(guān)鍵分子,通過細(xì)胞熒光特異性標(biāo)記染色、FCM、ELISA、蛋白印跡、Morris水迷宮認(rèn)知功能檢測等方法,分析海馬SGZ的NSCs增殖能力與分化轉(zhuǎn)歸,闡明TLR4信號下游調(diào)控TBI后NSCs增殖與分化的具體機(jī)制。研究結(jié)果1.同假損傷組相比,TBI組海馬區(qū)SGZ的BrdU/TLR4陽性NSCs數(shù)量顯著增多,即:傷后第3天NSCs增殖數(shù)量開始增加,高峰期出現(xiàn)在傷后第7天,第14天、21天與28天NSCs的增殖數(shù)目逐漸減少,但仍高于假損傷組。TBI后海馬區(qū)TLR4蛋白與核酸表達(dá)均顯著增加,且時程上與NSCs的增殖趨勢一致。2.體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中,同野生型小鼠組比,TLR4~(-/-)小鼠TBI后海馬區(qū)SGZ的BrdU/SOX2共標(biāo)陽性NSCs細(xì)胞數(shù)顯著增多,由NSCs分化的BrdU/DCX、BrdU/NeuN共標(biāo)陽性神經(jīng)元數(shù)量增多,而由NSCs分化的BrdU/GFAP共標(biāo)陽性膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量下降。體外實(shí)驗(yàn)中,TLR4抑制劑TAK-242干預(yù)組NSCs成球率高于對照組,且Nestin、TUJ1標(biāo)記陽性NSCs及其分化的神經(jīng)元數(shù)量增多,GFAP、O4標(biāo)記陽性膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量減少。TLR4配體LPS干預(yù)組NSCs成球率較對照組下降,Nestin標(biāo)記陽性NSCs數(shù)量減少,TUJ1標(biāo)記陽性的神經(jīng)元細(xì)胞數(shù)減少,而GFAP、O4標(biāo)記陽性膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量增多。3.體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中,同TBI組相比,Myd88抑制劑ST2825干預(yù)的TBI+ST組BrdU/SOX2、BrdU/NeuN共標(biāo)陽性NSCs及其分化的神經(jīng)元數(shù)量增加,TRIF抑制劑RES干預(yù)的TBI+RES組BrdU/SOX2共標(biāo)陽性NSCs數(shù)量增加,但BrdU/NeuN共標(biāo)神經(jīng)元數(shù)量較TBI組無統(tǒng)計學(xué)差異;TBI+ST組小鼠尋找平臺的潛伏期縮短,記憶象限穿越次數(shù)與軌跡增加,而TBI+RES組小鼠學(xué)習(xí)、記憶能力較TBI組無統(tǒng)計差異。體外實(shí)驗(yàn)中,同LPS組比,Myd88 siRNA+LPS干預(yù)組BrdU、TUJ1陽性的NSCs及其分化的神經(jīng)元數(shù)量顯著增加,GFAP陽性的膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)明顯減少,NSCs培養(yǎng)液中抗炎與促炎因子的含量顯著減少;TRAM siRNA+LPS干預(yù)組BrdU陽性的NSCs數(shù)量顯著增加,TUJ1、GFAP標(biāo)記陽性的細(xì)胞數(shù)無統(tǒng)計差異,NSCs培養(yǎng)液中抗炎因子含量減少,但促炎因子含量無統(tǒng)計差異。研究結(jié)論在體內(nèi)證實(shí)了TLR4表達(dá)于小鼠海馬區(qū)SGZ的NSCs表面。TBI后海馬SGZ的NSCs主導(dǎo)的神經(jīng)再生進(jìn)程中,TLR4表達(dá)變化特征與NSCs增殖趨勢在時程上一致。抑制TLR4可促進(jìn)NSCs增殖更新和分化為神經(jīng)元,有助于提高TBI后神經(jīng)再生能力,其作用機(jī)制是由TLR4信號下游的Myd88與TRIF途徑共同介導(dǎo),但兩條通路下游炎癥因子呈差異性表達(dá),導(dǎo)致其對NSCs的調(diào)控效應(yīng)不同。TLR4-Myd88途徑對NSCs增殖潛能與分化轉(zhuǎn)歸均有調(diào)節(jié)作用,TLR4-TRIF途徑僅調(diào)控NSCs的增殖潛能,不參與調(diào)控其分化命運(yùn)。
【學(xué)位單位】：中國人民解放軍空軍軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R651.15
【部分圖文】：

空軍軍醫(yī)大學(xué)博士學(xué)位論文尚未見到報道。因此，本課題基于 TBI 后神經(jīng)再生困難這一 為核心，以 TLR4 為切入點(diǎn)，深入闡明 TBI 后 TLR4 信號途徑控作用與相關(guān)機(jī)制，從全新的角度認(rèn)識腦損傷后再生與修復(fù)床轉(zhuǎn)化研究提供新的理論基礎(chǔ)（圖 1）。利用多種體內(nèi)、體外分子生物學(xué)方法與實(shí)驗(yàn)技術(shù)，在形態(tài)、 TBI 后炎性環(huán)境中海馬區(qū) TLR4 的時空表達(dá)變化特征與意義達(dá)變化對 NSCs 再生修復(fù)的影響作用與功能，闡明 TBI 后 TLR 再生修復(fù)的具體機(jī)制，將可能為改善 TBI 后神經(jīng)再生修復(fù)帶來

由 NSCs 周圍的支持細(xì)胞、細(xì)胞外基質(zhì)和分泌因子等組成的三維空間結(jié)構(gòu)（圖1）。在空間上， 龕 性結(jié)構(gòu)使 NSCs 與微環(huán)境細(xì)胞緊密接觸聯(lián)系，介導(dǎo) NSC 與膠質(zhì)細(xì)胞、NSCs 與血管內(nèi)皮細(xì)胞之間的相互作用；在功能上， 龕 性結(jié)構(gòu)使微環(huán)境因素調(diào)控 NSCs 的存活、增殖和分化等，細(xì)胞外基質(zhì)中的神經(jīng)營養(yǎng)因子、粘連蛋白及炎性因子復(fù)合作用于 NSCs，決定 TBI 的預(yù)后與轉(zhuǎn)歸[25]。圖 1：神經(jīng)再生微環(huán)境模式圖因此，深入研究腦損傷后制約 NSCs 生物學(xué)行為的瓶頸因素，探討合理、可行、有效的 NSCs 內(nèi)在生長力和（或）外部微環(huán)境干預(yù)策略

圖 2：炎癥因子對 NSCs 修復(fù)腦損傷的雙面調(diào)控作用圖l 樣受體炎性信號途徑ll 樣受體家族概論oll 樣受體(Toll like receptors, TLRs)是細(xì)胞感應(yīng)外部因素刺激后，識別損反應(yīng)的 第一道防線蛋白 ，是調(diào)控機(jī)體免疫應(yīng)答的重要屏障分子，與 感染所致炎癥反應(yīng)的關(guān)系密切。TLRs 基因自 1985 年在果蠅體內(nèi)被發(fā)隨后的研究不斷揭示其越來越多的功能，由早期控制果蠅胚胎生長發(fā)育化的作用，到后來編碼調(diào)控多肽清除病原微生物感染的免疫功能[41, 42]魯大學(xué)免疫學(xué)家 Medzhitov R. 教授首次報道了與果蠅同源的 Toll 樣受一 TLR4 表達(dá)于哺乳動物體內(nèi)，并證實(shí)了 TLR4 參與調(diào)節(jié)適應(yīng)性免疫應(yīng)的功能[43]。目前為止，在人類已發(fā)現(xiàn)多達(dá) 11 種 TLRs 家族亞型受體，有 13 種 TLRs 家族亞型受體，TLRs 在進(jìn)化上具有良好的保守性，哺乳

【參考文獻(xiàn)】

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1 程世翔;張海博;陳旭義;涂悅;張賽;;控制性腦皮質(zhì)撞擊致不同損傷程度顱腦創(chuàng)傷大鼠模型的建立[J];中華行為醫(yī)學(xué)與腦科學(xué)雜志;2014年10期

2 惠紀(jì)元;龔如;梁玉敏;高國一;包映暉;江基堯;;中國顱腦創(chuàng)傷數(shù)據(jù)庫:短期預(yù)后因素分析[J];中華神經(jīng)外科雜志;2014年01期

3 吳增寶;鐘春龍;高陽;劉巧玲;林盈盈;崔振文;鄭彥;羅其中;江基堯;;小鼠控制性腦皮質(zhì)撞擊模型的構(gòu)建及分級[J];中華神經(jīng)外科疾病研究雜志;2013年05期

本文編號：2807839