創(chuàng)傷性腦損傷(TBI)的致殘、致死率居各類創(chuàng)傷之首。近年來,隨著臨床神經(jīng)學科對TBI救治水平的提高,患者生存時間顯著延長,但仍有很大一部分TBI患者終身遺留不同程度的神經(jīng)功能殘疾或認知功能障礙,給個人、家庭和社會造成了沉重的負擔。因此,深入研究TBI后神經(jīng)再生修復,尋求合理可行的干預策略,改善TBI的預后,是亟待解決的重要科學問題。NSCs作為修復腦損傷的核心效應細胞,具有分裂增殖、多方向分化、主動趨向移行等生物功能。海馬區(qū)作為CNS內源性NSCs的“巢區(qū)”,存在自主修復腦損傷的機制。在TBI損傷發(fā)生后,“巢區(qū)”內的NSCs被激活,通過增殖、分化、遷移、整合等過程,啟動再生修復,建立新突觸結構,修復TBI造成的神經(jīng)功能缺失。然而,在TBI后的腦內復雜病理環(huán)境中,NSCs的自主再生修復能力十分有限,不足以彌補TBI造成的腦組織結構破壞和神經(jīng)功能損害。因此,研究TBI后病理環(huán)境中制約NSCs再生潛能的瓶頸因素,闡明這些制約因素的深層調控作用機制,從根本上提升NSCs的再生能力、促進受損的神經(jīng)功能重建,是改善TBI預后與轉歸的重要途徑。TBI后影響腦內NSCs修復能力的因素繁多,其中,炎性反應伴隨TBI損傷與修復的全過程,炎性反應一方面加重神經(jīng)細胞的損傷,引起更為嚴重的腦功能損害,另一方面激活NSCs分裂增殖、多向分化,啟動再生與修復。因此,深入研究TBI后調控炎癥反應的信號分子與相關機制,對提升TBI后NSCs再生修復潛能意義重大。TLR4作為TLRs家族中發(fā)現(xiàn)最早的模式識別受體之一,通過識別外源侵入的病理相關分子模式,以及腦損傷后細胞釋放的內源性損傷相關分子模式,活化下游Myd88和TRIF介導的兩路信號途徑,調控炎癥反應發(fā)生發(fā)展。關于CNS的TLR4功能,早年多集中在其與膠質細胞介導的“瀑布式”炎癥反應關系,后來逐漸關注到TLR4在神經(jīng)元損傷轉歸中的作用。新近研究提示:體外培養(yǎng)的NSCs膜表面也可能存在TLR4,且可能影響NSCs增殖、分化等生物特性。然而,有關TBI后炎性環(huán)境中TLR4與內源性NSCs功能的研究,目前尚未見報道。因此,本課題基于TBI后神經(jīng)再生困難這一難題,以海馬區(qū)NSCs為核心,以TLR4為切入點,深入研究TBI后TLR4信號途徑對NSCs再生修復的調控作用與相關機制,不僅是從全新的角度認識腦損傷后中樞再生與修復,也將可能為NSCs臨床轉化研究提供新的理論基礎。研究目的本研究分別從體內、體外層面,探討TBI后神經(jīng)再生環(huán)境中海馬組織TLR4的時空分布特征與表達意義,研究TBI后TLR4表達變化對NSCs增殖分化的影響作用,闡明TBI后TLR4信號通路調控NSCs再生修復的具體機制。研究方法本研究在穩(wěn)定的C57BL/6小鼠TBI模型建立和體外NSCs培養(yǎng)基礎上,采用免疫熒光共標染色、蛋白印跡、RT-PCR等方法,檢測TBI后海馬區(qū)TLR4的細胞定位與表達水平,分析TLR4表達與NSCs增殖之間的潛在聯(lián)系。在此基礎上,采用TLR4基因缺失小鼠和TLR4藥理學抑制/激動劑干預,通過體內、體外免疫熒光多重染色、CCK-8分析、蛋白印跡、透射電鏡、激光共聚焦顯微鏡觀察等方法,分析TBI后TLR4表達變化對NSCs增殖能力、分化轉歸的影響作用。進一步采用藥理學抑制劑與siRNA技術,體內、體外調控TLR4下游Myd88與TRIF途徑的關鍵分子,通過細胞熒光特異性標記染色、FCM、ELISA、蛋白印跡、Morris水迷宮認知功能檢測等方法,分析海馬SGZ的NSCs增殖能力與分化轉歸,闡明TLR4信號下游調控TBI后NSCs增殖與分化的具體機制。研究結果1.同假損傷組相比,TBI組海馬區(qū)SGZ的BrdU/TLR4陽性NSCs數(shù)量顯著增多,即:傷后第3天NSCs增殖數(shù)量開始增加,高峰期出現(xiàn)在傷后第7天,第14天、21天與28天NSCs的增殖數(shù)目逐漸減少,但仍高于假損傷組。TBI后海馬區(qū)TLR4蛋白與核酸表達均顯著增加,且時程上與NSCs的增殖趨勢一致。2.體內實驗中,同野生型小鼠組比,TLR4~(-/-)小鼠TBI后海馬區(qū)SGZ的BrdU/SOX2共標陽性NSCs細胞數(shù)顯著增多,由NSCs分化的BrdU/DCX、BrdU/NeuN共標陽性神經(jīng)元數(shù)量增多,而由NSCs分化的BrdU/GFAP共標陽性膠質細胞數(shù)量下降。體外實驗中,TLR4抑制劑TAK-242干預組NSCs成球率高于對照組,且Nestin、TUJ1標記陽性NSCs及其分化的神經(jīng)元數(shù)量增多,GFAP、O4標記陽性膠質細胞數(shù)量減少。TLR4配體LPS干預組NSCs成球率較對照組下降,Nestin標記陽性NSCs數(shù)量減少,TUJ1標記陽性的神經(jīng)元細胞數(shù)減少,而GFAP、O4標記陽性膠質細胞數(shù)量增多。3.體內實驗中,同TBI組相比,Myd88抑制劑ST2825干預的TBI+ST組BrdU/SOX2、BrdU/NeuN共標陽性NSCs及其分化的神經(jīng)元數(shù)量增加,TRIF抑制劑RES干預的TBI+RES組BrdU/SOX2共標陽性NSCs數(shù)量增加,但BrdU/NeuN共標神經(jīng)元數(shù)量較TBI組無統(tǒng)計學差異;TBI+ST組小鼠尋找平臺的潛伏期縮短,記憶象限穿越次數(shù)與軌跡增加,而TBI+RES組小鼠學習、記憶能力較TBI組無統(tǒng)計差異。體外實驗中,同LPS組比,Myd88 siRNA+LPS干預組BrdU、TUJ1陽性的NSCs及其分化的神經(jīng)元數(shù)量顯著增加,GFAP陽性的膠質細胞數(shù)明顯減少,NSCs培養(yǎng)液中抗炎與促炎因子的含量顯著減少;TRAM siRNA+LPS干預組BrdU陽性的NSCs數(shù)量顯著增加,TUJ1、GFAP標記陽性的細胞數(shù)無統(tǒng)計差異,NSCs培養(yǎng)液中抗炎因子含量減少,但促炎因子含量無統(tǒng)計差異。研究結論在體內證實了TLR4表達于小鼠海馬區(qū)SGZ的NSCs表面。TBI后海馬SGZ的NSCs主導的神經(jīng)再生進程中,TLR4表達變化特征與NSCs增殖趨勢在時程上一致。抑制TLR4可促進NSCs增殖更新和分化為神經(jīng)元,有助于提高TBI后神經(jīng)再生能力,其作用機制是由TLR4信號下游的Myd88與TRIF途徑共同介導,但兩條通路下游炎癥因子呈差異性表達,導致其對NSCs的調控效應不同。TLR4-Myd88途徑對NSCs增殖潛能與分化轉歸均有調節(jié)作用,TLR4-TRIF途徑僅調控NSCs的增殖潛能,不參與調控其分化命運。
【學位單位】：中國人民解放軍空軍軍醫(yī)大學
【學位級別】：博士
【學位年份】：2018
【中圖分類】：R651.15
【部分圖文】：

空軍軍醫(yī)大學博士學位論文尚未見到報道。因此，本課題基于 TBI 后神經(jīng)再生困難這一 為核心，以 TLR4 為切入點，深入闡明 TBI 后 TLR4 信號途徑控作用與相關機制，從全新的角度認識腦損傷后再生與修復床轉化研究提供新的理論基礎（圖 1）。利用多種體內、體外分子生物學方法與實驗技術，在形態(tài)、 TBI 后炎性環(huán)境中海馬區(qū) TLR4 的時空表達變化特征與意義達變化對 NSCs 再生修復的影響作用與功能，闡明 TBI 后 TLR 再生修復的具體機制，將可能為改善 TBI 后神經(jīng)再生修復帶來

由 NSCs 周圍的支持細胞、細胞外基質和分泌因子等組成的三維空間結構（圖1）。在空間上， 龕 性結構使 NSCs 與微環(huán)境細胞緊密接觸聯(lián)系，介導 NSC 與膠質細胞、NSCs 與血管內皮細胞之間的相互作用；在功能上， 龕 性結構使微環(huán)境因素調控 NSCs 的存活、增殖和分化等，細胞外基質中的神經(jīng)營養(yǎng)因子、粘連蛋白及炎性因子復合作用于 NSCs，決定 TBI 的預后與轉歸[25]。圖 1：神經(jīng)再生微環(huán)境模式圖因此，深入研究腦損傷后制約 NSCs 生物學行為的瓶頸因素，探討合理、可行、有效的 NSCs 內在生長力和（或）外部微環(huán)境干預策略

圖 2：炎癥因子對 NSCs 修復腦損傷的雙面調控作用圖l 樣受體炎性信號途徑ll 樣受體家族概論oll 樣受體(Toll like receptors, TLRs)是細胞感應外部因素刺激后，識別損反應的 第一道防線蛋白 ，是調控機體免疫應答的重要屏障分子，與 感染所致炎癥反應的關系密切。TLRs 基因自 1985 年在果蠅體內被發(fā)隨后的研究不斷揭示其越來越多的功能，由早期控制果蠅胚胎生長發(fā)育化的作用，到后來編碼調控多肽清除病原微生物感染的免疫功能[41, 42]魯大學免疫學家 Medzhitov R. 教授首次報道了與果蠅同源的 Toll 樣受一 TLR4 表達于哺乳動物體內，并證實了 TLR4 參與調節(jié)適應性免疫應的功能[43]。目前為止，在人類已發(fā)現(xiàn)多達 11 種 TLRs 家族亞型受體，有 13 種 TLRs 家族亞型受體，TLRs 在進化上具有良好的保守性，哺乳

【參考文獻】

相關期刊論文 前3條

1 程世翔;張海博;陳旭義;涂悅;張賽;;控制性腦皮質撞擊致不同損傷程度顱腦創(chuàng)傷大鼠模型的建立[J];中華行為醫(yī)學與腦科學雜志;2014年10期

2 惠紀元;龔如;梁玉敏;高國一;包映暉;江基堯;;中國顱腦創(chuàng)傷數(shù)據(jù)庫:短期預后因素分析[J];中華神經(jīng)外科雜志;2014年01期

3 吳增寶;鐘春龍;高陽;劉巧玲;林盈盈;崔振文;鄭彥;羅其中;江基堯;;小鼠控制性腦皮質撞擊模型的構建及分級[J];中華神經(jīng)外科疾病研究雜志;2013年05期

本文編號：2807839