骨肉瘤(Osteosarcoma,OS)是最常見的骨的惡性腫瘤,其最常見于兒童及20歲以下的青少年,同時易于轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā),是兒童及青少年癌癥相關(guān)死亡的主要原因。OS的惡性程度非常高,預(yù)后差。OS給社會及家庭帶來了嚴重的負擔(dān)和影響,一直是生命科學(xué)研究的重點,盡管相關(guān)研究很多,但其發(fā)病機制至今仍未給出很好的解釋,而長鏈非編碼RNA-ASBEL(lnc RNA-ASBEL)是一種重要的調(diào)控基因,與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移有關(guān),但與OS的相關(guān)性研究目前尚無報道。故本研究將以分子生物學(xué)技術(shù)來探lnc RNA-ASBEL在OS發(fā)生發(fā)展中的具體作用,以便更好地認識骨肉瘤的發(fā)生發(fā)展機制,并為其尋找有效的治療靶點和新治療策略提供理論依據(jù),具有重要的現(xiàn)實意義�！灸康摹�(1)闡明lnc RNA-ASBEL在骨肉瘤中的表達水平,以及它對骨肉瘤細胞的增殖、遷移、侵襲等生物學(xué)行為的影響。(2)闡明lnc RNA-ASBEL通過調(diào)控mi R-21影響骨肉瘤細胞生物學(xué)行為的分子機制�！痉椒ā康谝徊糠�:闡明lnc RNA-ASBEL在骨肉瘤中的表達水平,以及它對骨肉瘤細胞的增殖、遷移、侵襲等生物學(xué)行為的影響(1)對骨肉瘤細胞株MG63、OS-732和人成骨細胞株h FOB1.19進行培養(yǎng)。對上述組織進行總RNA的提取,采用q RT-PCR對樣本進行l(wèi)nc RNA-ASBEL基因檢測,檢測結(jié)果采用單向方差分析進行統(tǒng)計學(xué)分析。(2)選擇骨肉瘤細胞株MG63進行培養(yǎng),采用Lipofectamine 3000轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染MG63細胞,設(shè)三個組:Control組(只加lipofectamine),sh NC組(lipofectamine+sh NC),sh-ASBEL組(lipofectamine+sh-ASBEL)。轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)1、2、3、4天后,用q RT-PCR方式檢測三組MG63細胞株的lnc RNA-ASBEL表達情況。采用臺盼藍排斥試驗檢測三組MG63細胞的增殖情況。采用Tranwell細胞遷移侵襲實驗技術(shù)來檢測三組骨肉瘤細胞的遷移侵襲情況。第二部分:闡明lnc RNA-ASBEL調(diào)控骨肉瘤細胞生物學(xué)行為的分子機制(1)lnc RNA-ASBEL對mi R-21在骨肉瘤細胞中表達的影響1)對骨肉瘤細胞株MG63進行培養(yǎng),采用Lipofectamine 3000轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染MG63細胞,設(shè)三個組:Control組(只加lipofectamine),sh NC組(lipofectamine+sh NC),sh-ASBEL組(lipofectamine+sh-ASBEL)。轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)1、2、3、4天后,用q RT-PCR方式檢測三組MG63細胞株的mi R-21表達情況。2)采用Lipofectamine 3000轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染MG63細胞,設(shè)三個組:NC組(lipofectamine+NC),mi R-21 mimic組(lipofectamine+mi R-21 mimic)和mi R-21inhibitor組(lipofectamine+mi R-21 inhibitor)。轉(zhuǎn)染后1、2、3、4天后,用q RT-PCR方式檢測被mi R-21 mimic和mi R-21 inhibitor干擾的MG63細胞株的mi R-21的表達情況。3)采用Lipofectamine 3000轉(zhuǎn)染試劑將NC、sh NC、sh-ASBEL、mi R-21mimic轉(zhuǎn)染MG63細胞,設(shè)四個組:Control組,sh NC+NC組,sh-ASBEL+NC組,sh-ASBEL+mi R-21mimic組。將細胞培養(yǎng)1、2、3、4天,采用臺盼藍排斥試驗檢測三組MG63細胞的增殖情況。采用Tranwell細胞遷移侵襲實驗技術(shù)來檢測骨肉瘤細胞的遷移侵襲情況。(2)mi R-21與PP2A對骨肉瘤細胞生物學(xué)行為的影響1)采用Lipofectamine 3000轉(zhuǎn)染試劑將mi R-21 mimic和mi R-21 inhibitor分別轉(zhuǎn)染至骨肉瘤細胞株MG63進行培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染后1、2、3、4天后,用q RT-PCR方式和Western blotting檢測被mi R-21 mimic和mi R-21 inhibitor干擾的MG63細胞株的PP2A的m RNA和蛋白的表達情況。2)采用Lipofectamine 3000轉(zhuǎn)染試劑將mi R-21 mimic分別與PP2A野生型載體(PP2A-wt)和PP2A突變型載體(PP2A-mt)共同轉(zhuǎn)染至骨肉瘤細胞株MG63,通過熒光素酶活性檢測分析mi R-21是否與PP2A 3,UTR結(jié)合。3)采用Lipofectamine 3000轉(zhuǎn)染試劑將NC、sh-NC、mi R-21 inhibitor、sh-PP2A轉(zhuǎn)染MG63細胞,設(shè)四個組:Control組,sh-NC+NC組,mi R-21 inhibitor+sh-NC組,mi R-21 inhibitor+sh-PP2A組。轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)1、2、3、4天,用q RT-PCR方式和Western blotting檢測PP2A的m RNA和蛋白的表達情況。采用臺盼藍排斥試驗檢測三組MG63細胞的增殖情況。采用Tranwell細胞遷移侵襲實驗技術(shù)來檢測三組骨肉瘤細胞的遷移侵襲情況。4)采用Lipofectamine 3000轉(zhuǎn)染試劑將NC、mi R-21 mimic、mi R-21 inhibitor、sh-PP2A轉(zhuǎn)染MG63細胞,設(shè)四個組:NC組,mi R-21 mimic組,mi R-21 inhibitor組,mi R-21 inhibitor+sh-PP2A組。用Western blotting檢測PI3K/AKT/GSK3β和MEK/ERK信號通路中蛋白的表達情況�！窘Y(jié)果】1、lnc RNA-ASBEL在骨肉瘤中的表達水平,以及它對骨肉瘤細胞的增殖、遷移、侵襲等生物學(xué)行為的影響(1)相對于人成骨細胞株h FOB1.19,lnc RNA-ASBEL在骨肉瘤細胞株MG63、OS-732的表達明顯增高。提示lnc RNA-ASBEL在骨肉瘤發(fā)生中發(fā)揮重要的作用。(2)相對于Control組和sh NC組,轉(zhuǎn)染Sh-ASBEL后,lnc RNA-ASBEL的表達明顯下降,骨肉瘤細胞MG63的活性、轉(zhuǎn)移和侵襲均明顯下降。提示lnc RNA-ASBEL的表達抑制將降低骨肉瘤細胞MG63的活性、轉(zhuǎn)移和侵襲。2、lnc RNA-ASBEL調(diào)控骨肉瘤細胞生物學(xué)行為的分子機制(1)lnc RNA-ASBEL對mi R-21在骨肉瘤細胞中表達的影響1)相對于Control組和sh NC組,轉(zhuǎn)染Sh-ASBEL后,mi R-21的表達明顯下降。提示mi R-21參與lnc RNA-ASBEL的骨肉瘤細胞增殖、遷移、侵襲的調(diào)節(jié)作用。2)轉(zhuǎn)染mi R-21 mimic后,mi R-21的表達明顯增加,轉(zhuǎn)染mi R-21 inhibitor后,mi R-21的表達明顯下降。3)相對于轉(zhuǎn)染Sh-ASBEL的骨肉瘤細胞株MG63,同時轉(zhuǎn)染Sh-ASBEL和mi R-21 mimic明顯增加骨肉瘤細胞MG63的活性。通過mi R-21的過表達,可反轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)染sh-ASBEL后導(dǎo)致的骨肉瘤細胞MG63的轉(zhuǎn)移和侵襲的下降。提示mi R-21參與lnc RNA-ASBEL的骨肉瘤細胞增殖、遷移、侵襲的調(diào)節(jié)作用。(2)mi R-21與PP2A對骨肉瘤細胞生物學(xué)行為的影響1)轉(zhuǎn)染mi R-21 mimic后,骨肉瘤細胞株MG63中的PP2A的m RNA和PP2A蛋白水平明顯下降,而轉(zhuǎn)染mi R-21 inhibitor后PP2A的m RNA和PP2A蛋白水平明顯增加。提示PP2A可能是骨肉瘤細胞株MG63中mi R-21的靶點。2)熒光素酶活性檢測分析顯示,轉(zhuǎn)染mi R-21 mimic與PP2A野生型載體(PP2A-mt)組熒光素酶活性高于轉(zhuǎn)染mi R-21 mimic與PP2A突變型載體(PP2A-mt)組。這進一步支持PP2A是骨肉瘤細胞株MG63中mi R-21的靶點。3)轉(zhuǎn)染mi R-21 inhibitor后,PP2A的m RNA和PP2A蛋白水平明顯增高,而通過轉(zhuǎn)染sh-PP2A后,PP2A的m RNA和PP2A蛋白水平降低。4)PP2A沉默將明顯減輕mi R-21 inhibitor導(dǎo)致的骨肉瘤細胞活性、轉(zhuǎn)移和侵襲性的下降。這提示mi R-21將通過降低PP2A的表達來促進骨肉瘤細胞的增值、轉(zhuǎn)移和侵襲。5)轉(zhuǎn)染mi R-21 mimic后,p-PI3K,p-AKT,p-GSK3β,p-MEK和p-ERK在骨肉瘤細胞MG63的表達明顯增高,轉(zhuǎn)染mi R-21 inhibitor后,效果相反。通過PP2A的表達抑制可減輕轉(zhuǎn)染mi R-21 inhibitor后的上述蛋白的表達降低。這提示mi R-21通過抑制PP2A的表達來激活骨肉瘤細胞的PI3K/AKT/GSK3β和MEK/ERK信號通路�！窘Y(jié)論】lnc RNA-ASBEL促進骨肉瘤的發(fā)生發(fā)展過程,與其細胞增殖、轉(zhuǎn)移和侵襲密切相關(guān)。lnc RNA-ASBEL沉默后,mi R-21的表達抑制。PP2A是骨肉瘤細胞株MG63中mi R-21的靶點,mi R-21將通過降低PP2A的表達來促進骨肉瘤細胞的增值、轉(zhuǎn)移和侵襲。因此,我們認為ASBEL-mi R-21-PP2A通路在骨肉瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要的作用�！緞�(chuàng)新】首次發(fā)現(xiàn)lnc RNA-ASBEL在骨肉瘤細胞系中的表達,且呈現(xiàn)增高表達,并首次探討lnc RNA-ASBEL促進骨肉瘤細胞的增殖、轉(zhuǎn)移和侵襲的分子機制,為尋找有效的治療靶點和骨肉瘤的治療策略提供理論依據(jù),具有重要的現(xiàn)實意義。
【學(xué)位單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R738
【部分圖文】：

37℃下放置 30 min，使 Matrigel 聚合成膠，準備 Transwell 培養(yǎng)板。3、在無血清培養(yǎng)液中饑餓誘導(dǎo)細胞 12h，用 PBS 漂洗 3 次。用無血清備濃度為 5×105／ml 的單細胞懸液。4、將 100 l(5×104)細胞懸液和 200ul 無血清培養(yǎng)基加入 Transwell 培養(yǎng)Transwell 培養(yǎng)板下室加入 500 趨化因子，培養(yǎng) 24 小時（37℃，5％C025、取出小室，將基質(zhì)膠和聚碳酯膜上表面的細胞用濕棉簽擦去。6、用 PBS 漂洗 5 分鐘，DAPI 工作液室溫染色 5～20 分鐘，PBS 漂洗封片劑封片。7、顯微鏡下隨機取 6 個視野計數(shù)，取平均數(shù)。 實驗結(jié)果.1 lncRNA-ASBEL 在骨肉瘤細胞株中呈高表達狀態(tài)

miR-21 的表達明顯增加(P<0.01) ，轉(zhuǎn)染 miR-21下降(P<0.01)。提示兩者對 miR-21 表達干擾效果 為檢測 lncRNA-ASBEL 調(diào)節(jié) miR-21 對骨肉瘤、shNC、sh-ASBEL、miR-21mimic 轉(zhuǎn)染 MG63、4 天，采用采用臺盼藍排斥試驗檢測細胞的增轉(zhuǎn)染 Sh-ASBEL 的骨肉瘤細胞株 MG63，同mic 明顯增加骨肉瘤細胞 MG63 的活性(P<0.05)。轉(zhuǎn)染 Sh-ASBEL 后導(dǎo)致的骨肉瘤細胞 MG63 的 為研究 lncRNA-ASBEL 對骨肉瘤細胞遷移和侵nswell 小室實驗。在 Transwell 小室實驗中我們發(fā)反轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)染 Sh-ASBEL 后導(dǎo)致的骨肉瘤細胞 MG5）,如圖 C,D。提示 miR-21 參與 lncRNA-ASBEL作用。

2B：miR-21 的過表達可反轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)染 Sh-ASBEL 后導(dǎo)致的骨肉瘤MG63 的活性下降數(shù)據(jù)以 mean ± standard deviation (SD)表示，ASBEL: long tisense ncRNA in the abundant in neuroepithelium area (Ation gene 3 (BTG3) locus; miR-21: microRNA-21; NC: negative *P < 0.01.

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本文編號：2807348