【摘要】：目的:探討表沒食子兒茶素沒食子酸酯(epigallocatechin-3-gallate,EGCG)對人骨肉瘤細胞的抑制作用,并初步探討其可能的分子生物學機制。方法:骨肉瘤(143B、MG63、SaOS2)三種細胞株,各自采用含0~50μmol/L的EGCG培養(yǎng)基培養(yǎng)后,使用MTT法檢測EGCG對三株細胞的增殖活性的影響,集落形成試驗檢測EGCG對143B細胞集落形成能力影響。應用流式細胞儀和Hoechst染色法分析細胞凋亡情況,采用劃痕愈合實驗以及Transwell小室法觀察細胞遷移能力變化。蛋白印跡法檢測細胞凋亡相關蛋白(Bcl-2、PARP、Caspase-3、Cleaved-caspase-3、Cleaved-PARP);增殖相關的蛋白(PCNA);遷移相關蛋白(MMP-9、Vimentin、E-cadherin)的表達水平變化。采用熒光素酶報告基因系統(tǒng)分析細胞中Wnt/β-catenin信號通路的活化情況,采用蛋白印跡法檢測Wnt/β-catenin信號通路中關鍵因子β-catenin及其下游靶分子C-myc、CyclinD1、MMP-7蛋白的表達情況。構建骨肉瘤裸鼠模型,采取灌胃給藥,觀察EGCG對骨肉瘤影響,免疫組化檢測瘤體β-catenin、PCNA的表達,以及對肺組織和骨組織HE染色,觀察骨肉瘤的侵襲能力。結果:EGCG處理骨肉瘤細胞后,三株骨肉瘤細胞的增殖能力明顯抑制,其中143B細胞的集落形成能力和遷移能力均被明顯抑制(P值均0.05),且凋亡細胞數明顯增加(P0.05)。細胞中增殖蛋白PCNA表達降低(P0.05);凋亡相關蛋白Bcl-2、PARP表達降低(P值均0.05),Caspase-3、Cleaved-caspase-3、Cleaved-PARP蛋白的表達水平均明顯上調(P值均0.05);遷移相關蛋白MMP-9、Vimentin表達隨濃度的增加逐漸降低(P值均0.05),而E-cadherin表達逐漸升高(P0.05);Wnt/β-catenin信號通路相關蛋白β-catenin、C-myc、CyclinD1、MMP-7、p-GSK-3β的蛋白表達均水平明顯下調(P值均0.05),GSK-3β蛋白表達無明顯變化(P0.05)。此外,EGCG處理組的熒光素酶活性值較未處理組明顯下降(P0.05)。動物實驗結果顯示:隨著灌胃濃度的提高,瘤體生長速率和體積得到明顯抑制(P0.05),免疫組化結果顯示實驗組較對照組β-catenin、PCNA表達降低。HE染色結果顯示對照組肺部轉移和瘤體對骨組織的侵犯明顯,實驗組隨著EGCG劑量增加肺部轉移和對骨組織的侵犯得到明顯抑制。結論:EGCG能抑制骨肉瘤143B細胞的增殖和遷移,促進細胞凋亡,并且這一系列作用可能與其抑制Wnt/β-catenin信號通路有關。
【學位授予單位】：重慶醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R738
【圖文】：

圖 2.1 EGCG 作用骨肉瘤細胞和人骨髓基質細胞后 MTT 檢測細胞增殖能力Fig2.1 Effect of EGCG on Cell Proliferation by Osteoclastoma Cells and Human Bone MarrowStromal Cells after MTTAssay. (A)Effect of EGCG on 143B cell Proliferation. (B)Effect ofEGCG on MG63 cell Proliferation. (C)Effect of EGCG on SaOS2 cell Proliferation. (D)Effectof EGCG on HS-5 cell Proliferation2.2 EGCG 顯著抑制人骨肉瘤細胞 143B 的集落形成能力檢測 EGCG 是否能有效抑制骨肉瘤細胞的克隆形成能力，采用了平板克隆形成實驗，結果表明(圖 2.2A)培養(yǎng) 10d 后 Control、10μmol/L、20μmol/L、30μmol/L組克隆形成率分別為：（78.13±9.11）%、（53±12.31）%、（8.21±2.01）%、（2.01±0.51）%，說明 EGCG 在較低濃度情況下能有效抑制骨肉瘤細胞的集落形成能力（P<0.05）。

圖 2.2 EGCG 作用于骨肉瘤 143B 細胞后集落形成實驗Fig2.2 Effect of EGCG on colony-formation of osteosarcoma 143B cells2.3 EGCG 對骨肉瘤細胞凋亡的影響流式細胞術檢測結果顯示（圖 2.3A）：Control、10μmol/L、20μmol/L、30μmol/L、40μmol/L、50μmol/L 細胞凋亡率分別為（12.12±1.41）%（14.42±3.03）%、（18.56±3.91）%、（19.12±4.71）%、（41.12±4.56）%、（59.12±6.94）%；Hoechst 染色顯示（圖 2.3B）：各濃度組細胞凋亡率分別為（11.03±1.01）%（13.12±1.04）%、（14.96±0.91）%、（21.02±2.91）%、（39.12±5.06）%、（63.12±5.94）%。兩項實驗結果均表明隨著 EGCG 濃度的增加，細胞的凋亡率明顯增加，EGCG 濃度大于40μmol/L 時具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。實驗表明 EGCG 在濃度大于 40μmol/L 可有效誘導 143B 細胞凋亡并呈現出濃度依耐性。

圖 2.2 EGCG 作用于骨肉瘤 143B 細胞后集落形成實驗Fig2.2 Effect of EGCG on colony-formation of osteosarcoma 143B cells2.3 EGCG 對骨肉瘤細胞凋亡的影響流式細胞術檢測結果顯示（圖 2.3A）：Control、10μmol/L、20μmol/L、30μmol/L、40μmol/L、50μmol/L 細胞凋亡率分別為（12.12±1.41）%（14.42±3.03）%、（18.56±3.91）%、（19.12±4.71）%、（41.12±4.56）%、（59.12±6.94）%；Hoechst 染色顯示（圖 2.3B）：各濃度組細胞凋亡率分別為（11.03±1.01）%（13.12±1.04）%、（14.96±0.91）%、（21.02±2.91）%、（39.12±5.06）%、（63.12±5.94）%。兩項實驗結果均表明隨著 EGCG 濃度的增加，細胞的凋亡率明顯增加，EGCG 濃度大于40μmol/L 時具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。實驗表明 EGCG 在濃度大于 40μmol/L 可有效誘導 143B 細胞凋亡并呈現出濃度依耐性。

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