【摘要】：目的:探討表沒食子兒茶素沒食子酸酯(epigallocatechin-3-gallate,EGCG)對人骨肉瘤細(xì)胞的抑制作用,并初步探討其可能的分子生物學(xué)機(jī)制。方法:骨肉瘤(143B、MG63、SaOS2)三種細(xì)胞株,各自采用含0~50μmol/L的EGCG培養(yǎng)基培養(yǎng)后,使用MTT法檢測EGCG對三株細(xì)胞的增殖活性的影響,集落形成試驗檢測EGCG對143B細(xì)胞集落形成能力影響。應(yīng)用流式細(xì)胞儀和Hoechst染色法分析細(xì)胞凋亡情況,采用劃痕愈合實驗以及Transwell小室法觀察細(xì)胞遷移能力變化。蛋白印跡法檢測細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白(Bcl-2、PARP、Caspase-3、Cleaved-caspase-3、Cleaved-PARP);增殖相關(guān)的蛋白(PCNA);遷移相關(guān)蛋白(MMP-9、Vimentin、E-cadherin)的表達(dá)水平變化。采用熒光素酶報告基因系統(tǒng)分析細(xì)胞中Wnt/β-catenin信號通路的活化情況,采用蛋白印跡法檢測Wnt/β-catenin信號通路中關(guān)鍵因子β-catenin及其下游靶分子C-myc、CyclinD1、MMP-7蛋白的表達(dá)情況。構(gòu)建骨肉瘤裸鼠模型,采取灌胃給藥,觀察EGCG對骨肉瘤影響,免疫組化檢測瘤體β-catenin、PCNA的表達(dá),以及對肺組織和骨組織HE染色,觀察骨肉瘤的侵襲能力。結(jié)果:EGCG處理骨肉瘤細(xì)胞后,三株骨肉瘤細(xì)胞的增殖能力明顯抑制,其中143B細(xì)胞的集落形成能力和遷移能力均被明顯抑制(P值均0.05),且凋亡細(xì)胞數(shù)明顯增加(P0.05)。細(xì)胞中增殖蛋白PCNA表達(dá)降低(P0.05);凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2、PARP表達(dá)降低(P值均0.05),Caspase-3、Cleaved-caspase-3、Cleaved-PARP蛋白的表達(dá)水平均明顯上調(diào)(P值均0.05);遷移相關(guān)蛋白MMP-9、Vimentin表達(dá)隨濃度的增加逐漸降低(P值均0.05),而E-cadherin表達(dá)逐漸升高(P0.05);Wnt/β-catenin信號通路相關(guān)蛋白β-catenin、C-myc、CyclinD1、MMP-7、p-GSK-3β的蛋白表達(dá)均水平明顯下調(diào)(P值均0.05),GSK-3β蛋白表達(dá)無明顯變化(P0.05)。此外,EGCG處理組的熒光素酶活性值較未處理組明顯下降(P0.05)。動物實驗結(jié)果顯示:隨著灌胃濃度的提高,瘤體生長速率和體積得到明顯抑制(P0.05),免疫組化結(jié)果顯示實驗組較對照組β-catenin、PCNA表達(dá)降低。HE染色結(jié)果顯示對照組肺部轉(zhuǎn)移和瘤體對骨組織的侵犯明顯,實驗組隨著EGCG劑量增加肺部轉(zhuǎn)移和對骨組織的侵犯得到明顯抑制。結(jié)論:EGCG能抑制骨肉瘤143B細(xì)胞的增殖和遷移,促進(jìn)細(xì)胞凋亡,并且這一系列作用可能與其抑制Wnt/β-catenin信號通路有關(guān)。
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R738
【圖文】：

圖 2.1 EGCG 作用骨肉瘤細(xì)胞和人骨髓基質(zhì)細(xì)胞后 MTT 檢測細(xì)胞增殖能力Fig2.1 Effect of EGCG on Cell Proliferation by Osteoclastoma Cells and Human Bone MarrowStromal Cells after MTTAssay. (A)Effect of EGCG on 143B cell Proliferation. (B)Effect ofEGCG on MG63 cell Proliferation. (C)Effect of EGCG on SaOS2 cell Proliferation. (D)Effectof EGCG on HS-5 cell Proliferation2.2 EGCG 顯著抑制人骨肉瘤細(xì)胞 143B 的集落形成能力檢測 EGCG 是否能有效抑制骨肉瘤細(xì)胞的克隆形成能力，采用了平板克隆形成實驗，結(jié)果表明(圖 2.2A)培養(yǎng) 10d 后 Control、10μmol/L、20μmol/L、30μmol/L組克隆形成率分別為：（78.13±9.11）%、（53±12.31）%、（8.21±2.01）%、（2.01±0.51）%，說明 EGCG 在較低濃度情況下能有效抑制骨肉瘤細(xì)胞的集落形成能力（P<0.05）。

圖 2.2 EGCG 作用于骨肉瘤 143B 細(xì)胞后集落形成實驗Fig2.2 Effect of EGCG on colony-formation of osteosarcoma 143B cells2.3 EGCG 對骨肉瘤細(xì)胞凋亡的影響流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果顯示（圖 2.3A）：Control、10μmol/L、20μmol/L、30μmol/L、40μmol/L、50μmol/L 細(xì)胞凋亡率分別為（12.12±1.41）%（14.42±3.03）%、（18.56±3.91）%、（19.12±4.71）%、（41.12±4.56）%、（59.12±6.94）%；Hoechst 染色顯示（圖 2.3B）：各濃度組細(xì)胞凋亡率分別為（11.03±1.01）%（13.12±1.04）%、（14.96±0.91）%、（21.02±2.91）%、（39.12±5.06）%、（63.12±5.94）%。兩項實驗結(jié)果均表明隨著 EGCG 濃度的增加，細(xì)胞的凋亡率明顯增加，EGCG 濃度大于40μmol/L 時具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。實驗表明 EGCG 在濃度大于 40μmol/L 可有效誘導(dǎo) 143B 細(xì)胞凋亡并呈現(xiàn)出濃度依耐性。

圖 2.2 EGCG 作用于骨肉瘤 143B 細(xì)胞后集落形成實驗Fig2.2 Effect of EGCG on colony-formation of osteosarcoma 143B cells2.3 EGCG 對骨肉瘤細(xì)胞凋亡的影響流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果顯示（圖 2.3A）：Control、10μmol/L、20μmol/L、30μmol/L、40μmol/L、50μmol/L 細(xì)胞凋亡率分別為（12.12±1.41）%（14.42±3.03）%、（18.56±3.91）%、（19.12±4.71）%、（41.12±4.56）%、（59.12±6.94）%；Hoechst 染色顯示（圖 2.3B）：各濃度組細(xì)胞凋亡率分別為（11.03±1.01）%（13.12±1.04）%、（14.96±0.91）%、（21.02±2.91）%、（39.12±5.06）%、（63.12±5.94）%。兩項實驗結(jié)果均表明隨著 EGCG 濃度的增加，細(xì)胞的凋亡率明顯增加，EGCG 濃度大于40μmol/L 時具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。實驗表明 EGCG 在濃度大于 40μmol/L 可有效誘導(dǎo) 143B 細(xì)胞凋亡并呈現(xiàn)出濃度依耐性。

【相似文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 張德綢;王廷帆;葛建華;;骨肉瘤最新治療及研究進(jìn)展[J];西南醫(yī)科大學(xué)學(xué)報;2018年05期

2 吳發(fā)帥;高楓;浦飛飛;邵增務(wù);;長鏈非編碼RNA在骨肉瘤中的研究進(jìn)展[J];華中科技大學(xué)學(xué)報(醫(yī)學(xué)版);2017年06期

3 鄭穎;王剛陽;陳瑞玲;蔡鄭東;華瑩奇;;骨肉瘤多藥耐藥的研究進(jìn)展[J];現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展;2017年33期

4 黃志鵬;宋科官;;骨肉瘤的診斷及治療進(jìn)展[J];國際骨科學(xué)雜志;2018年03期

5 丁聚賢;謝興文;許偉;李寧;李晶;蘇積亮;宋學(xué)文;;中醫(yī)藥在骨肉瘤放化療中的作用研究進(jìn)展[J];中醫(yī)正骨;2018年05期

6 徐斌武;李晨;;線粒體融合基因2抑制骨肉瘤及其干細(xì)胞增殖功能分析對其轉(zhuǎn)移機(jī)制的影響[J];吉林醫(yī)學(xué);2018年06期

7 麥威;孔令宇;宋春雨;邢志超;王果元;曲國蕃;;糖原合成激酶3β對骨肉瘤細(xì)胞遷移和侵襲的影響[J];實用腫瘤學(xué)雜志;2016年06期

8 董革輝;劉福慧;韓建華;夏本杰;黃俊瓊;;外泌體致敏樹突狀細(xì)胞體外抗骨肉瘤細(xì)胞生長作用[J];醫(yī)藥導(dǎo)報;2014年07期

9 程海光;李超;;原代骨肉瘤細(xì)胞培養(yǎng)及藥敏實驗[J];中國老年學(xué)雜志;2013年24期

10 石倩瑋;李曙光;李俊;凌昌全;;雷公藤甲素抗骨肉瘤細(xì)胞的實驗研究[J];中國中西醫(yī)結(jié)合雜志;2013年05期

相關(guān)會議論文 前10條

1 李紅;龍勉;;力學(xué)微擾對骨肉瘤細(xì)胞生物學(xué)行為的影響[A];第十次中國生物物理學(xué)術(shù)大會論文摘要集[C];2006年

2 金先慶;羅小輯;;骨肉瘤細(xì)胞骨分化標(biāo)志檢測及臨床意義[A];中國抗癌協(xié)會第七屆全國小兒腫瘤學(xué)術(shù)會議論文匯編[C];2007年

3 趙津;;重組溶瘤腺病毒對骨肉瘤的抑制作用[A];中國畜牧獸醫(yī)學(xué)會動物傳染病學(xué)分會第九次全國會員代表大會暨第十七次全國學(xué)術(shù)研討會論文集[C];2017年

4 黃永明;楊仁軒;蘇海濤;張嫻;許少健;徐逸生;;六味地黃湯對CIK細(xì)胞體外擴(kuò)增及抗骨肉瘤細(xì)胞的作用分析[A];第十八屆全國中西醫(yī)結(jié)合骨傷科學(xué)術(shù)研討會論文匯編[C];2011年

5 楊迪生;解先寬;葉招明;陶惠民;;反義C-myc重組腺病毒的構(gòu)建及其抗骨肉瘤細(xì)胞作用的實驗研究[A];2004年浙江省骨科學(xué)術(shù)會議論文匯編[C];2004年

6 朱波;陳安民;郭風(fēng)勁;許凱;廖暉;;RNA干擾抑制ACP1對骨肉瘤細(xì)胞侵襲能力的影響[A];中華醫(yī)學(xué)會疼痛學(xué)分會第八屆年會暨CASP成立二十周年論文集[C];2009年

7 Shuzhong Liu;Yipeng Wang;;MicroRNA-30a downregulation contributes to chemoresistance of osteosarcoma cells through activating Beclin-1-mediated autophagy[A];第九屆中國腫瘤學(xué)術(shù)大會暨第十五屆海峽兩岸腫瘤學(xué)術(shù)大會論文集[C];2016年

8 杜利清;樊飛躍;;shRNA抑制Rad51蛋白表達(dá)對骨肉瘤細(xì)胞藥物敏感性和細(xì)胞周期的影響[A];2009醫(yī)學(xué)前沿論壇暨第十一屆全國腫瘤藥理與化療學(xué)術(shù)會議論文集[C];2009年

9 杜利清;孟愛民;王曉春;王月英;吳紅英;張恒;李德冠;路璐;樊飛躍;;shRNA抑制Rad51蛋白表達(dá)對骨肉瘤細(xì)胞藥物敏感性和細(xì)胞周期的影響[A];中國藥理學(xué)會第十次全國學(xué)術(shù)會議�？痆C];2009年

10 馬艷芬;;胰島素和IGF-1對人成骨肉瘤細(xì)胞MG63增殖和分化功能的影響[A];中華醫(yī)學(xué)會第三次全國骨質(zhì)疏松和骨礦鹽疾病學(xué)術(shù)會議暨骨質(zhì)疏松診斷技術(shù)繼續(xù)教育學(xué)習(xí)班論文匯編[C];2004年

相關(guān)博士學(xué)位論文 前10條

1 羅德軍;microRNA-29b和金屬基質(zhì)蛋白酶-9在化療藥物治療骨肉瘤中的作用機(jī)制研究[D];重慶醫(yī)科大學(xué);2018年

2 楊超;應(yīng)用全基因組調(diào)節(jié)性小RNA文庫篩選骨肉瘤耐藥細(xì)胞株及其機(jī)制研究[D];重慶醫(yī)科大學(xué);2018年

3 張國棟;抑制自噬和增強(qiáng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激在大麻素受體激動劑WIN55，212-2引起骨肉瘤細(xì)胞毒性作用中的研究[D];山東大學(xué);2018年

4 王偉;硒代胱氨酸抑制骨肉瘤生長的分子機(jī)制研究[D];山東大學(xué);2018年

5 張仲寧;MicroRNA-145在骨肉瘤侵襲轉(zhuǎn)移及上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化中的作用和機(jī)制探討[D];鄭州大學(xué);2018年

6 姜哲;MicroRNA-208b通過負(fù)調(diào)控ROR2抑制人骨肉細(xì)胞增殖、遷移及侵襲的研究[D];延邊大學(xué);2018年

7 牛嘯博;MAPK途徑在脂多糖對骨肉瘤細(xì)胞增殖過程中的作用機(jī)制研究[D];武漢大學(xué);2017年

8 黃金承;雙PI3K/mTOR抑制劑NVP-BEZ235調(diào)節(jié)骨肉瘤細(xì)胞對順鉑敏感性機(jī)制的研究[D];南方醫(yī)科大學(xué);2018年

9 楊杰翔;miR-21介導(dǎo)的和厚樸酚在骨肉瘤細(xì)胞中的作用及機(jī)制研究[D];重慶醫(yī)科大學(xué);2018年

10 劉東寧;甲基化修飾miR-195促進(jìn)骨肉瘤細(xì)胞惡性表型及其分子機(jī)制[D];南方醫(yī)科大學(xué);2017年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前10條

1 戴威;KDM5C與骨肉瘤及骨骼肌再生的關(guān)系研究[D];重慶醫(yī)科大學(xué);2018年

2 謝佳卿;GSP對骨肉瘤細(xì)胞增殖、遷移、凋亡和周期的作用及其機(jī)制研究[D];重慶醫(yī)科大學(xué);2018年

3 董超群;表沒食子兒茶素沒食子酸酯對人骨肉瘤細(xì)胞的抑制作用及其機(jī)制探討[D];重慶醫(yī)科大學(xué);2018年

4 張盟;功能化氧化鈦納米棒陣列表面藥物涂層的構(gòu)建及其抗骨肉瘤性能研究[D];華中師范大學(xué);2018年

5 任杰;新輔助化療聯(lián)合保肢治療對四肢骨肉瘤的臨床療效分析及不同術(shù)式對患者術(shù)后并發(fā)癥及功能的評價[D];山西醫(yī)科大學(xué);2018年

6 李毅;miR-124對人骨肉瘤MG-63細(xì)胞株增殖和侵襲的影響[D];中國醫(yī)科大學(xué);2018年

7 陳堯;MicroRNA-106a在骨肉瘤中的表達(dá)與增殖和侵襲相關(guān)性的研究[D];中國醫(yī)科大學(xué);2018年

8 蔡啟軒;骨肉瘤非編碼RNA分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建與相關(guān)功能分析[D];吉林大學(xué);2018年

9 楊棟梁;WWOX基因在骨肉瘤組織的表達(dá)及其臨床意義[D];鄭州大學(xué);2018年

10 伍宏山;來那替尼通過抑制HER2抑制骨肉瘤細(xì)胞惡性表型的體外研究[D];南昌大學(xué);2018年

本文編號：2804592