發(fā)布時(shí)間：2020-08-22 03:57

【摘要】：目的:作為一種非經(jīng)典WNT信號(hào)通路中具有代表性的配體,WNT5A在腫瘤發(fā)生和腫瘤抑制中發(fā)揮著重要作用。已有研究表明,非受體酪氨酸激酶SRC在WNT5A引起的骨肉瘤細(xì)胞侵襲中具有一定作用。然而,WNT5A/SRC信號(hào)調(diào)控骨肉瘤細(xì)胞侵襲作用的詳細(xì)分子機(jī)制仍不十分清楚。本研究的目的是探索ERK1/2在WNT5A/SRC引起骨肉瘤細(xì)胞侵襲中的作用,以及SRC/ERK1/2信號(hào)通路的下游靶點(diǎn)。方法:本研究使用人體骨肉瘤MG-63細(xì)胞系,體外實(shí)驗(yàn)包括劃痕愈合試驗(yàn)、Transwell遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)等。另外,還包括小干擾RNA(siRNA)轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn),蛋白質(zhì)免疫印跡實(shí)驗(yàn)以及免疫熒光實(shí)驗(yàn)。結(jié)果:我們發(fā)現(xiàn)WNT5A(100 ng/mL)能夠明顯刺激MG-63細(xì)胞的遷移和侵襲,而通過(guò)使用siRNA沉默SRC或者通過(guò)使用PD98059抑制ERK1/2的磷酸化作用可以抑制遷移和侵襲作用,這就表明SRC和ERK1/2的活化作用對(duì)WNT5A引起的MG-63細(xì)胞的遷移和侵襲作用是必要的。而且,WNT5A引起的ERK1/2磷酸化作用可以被SRC siRNA顯著抑制。另外,我們的研究進(jìn)一步表明,WNT5A處理可以使MG-63細(xì)胞的MMP-14表達(dá)上調(diào),且其上調(diào)能夠被SRC siRNA或PD98059抑制。結(jié)論:綜上所述,WNT5A能夠活化SRC/ERK1/2信號(hào)通路,從而引起MMP-14表達(dá)的上調(diào)以及骨肉瘤MG-63細(xì)胞的遷移和侵襲。
【學(xué)位授予單位】：蘭州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R738.1
【圖文】：

第三章 實(shí)驗(yàn)結(jié)果3.1 WNT5A 促進(jìn)人類骨肉瘤 MG-63 細(xì)胞的遷移和侵襲為了探索 WNT5A 對(duì) MG-63 細(xì)胞遷移和侵襲的作用,我們使用不同濃度（0、50、100 和 200 ng/ml）的 rWNT5A 處理 MG-63 細(xì)胞，然后用劃痕愈合實(shí)驗(yàn)、Transwell 遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)來(lái)檢測(cè)細(xì)胞的遷移和侵襲能力。結(jié)果顯示，WNT5A 明顯增強(qiáng)了細(xì)胞的遷移能力（見圖 1A）。當(dāng)使用 100 ng/ml 的 rWNT5A 處理時(shí)，MG-63 細(xì)胞的遷移能力較未處理組相比大約增加了兩倍(見圖 1B，1C)，而當(dāng)濃度較低（50 ng/ml）時(shí)促進(jìn)作用并不明顯（見圖 1A 1C）。這些結(jié)果與另一個(gè)實(shí)驗(yàn)室的觀察結(jié)果是一致的[25]。我們同樣觀察到 rWNT5A 對(duì) MG-63 細(xì)胞侵襲能力的影響有類似的效果（見圖 1A，1D）。因此，我們得出結(jié)論，WNT5A 可以促進(jìn)人體骨肉瘤MG-63細(xì)胞的遷移和侵襲。相應(yīng)地，我們選擇100 ng/ml的rWNT5A來(lái)研究 WNT5A 促進(jìn) MG-63 細(xì)胞遷移和侵襲的分子機(jī)制。

蘭州大學(xué)碩士學(xué)位論文 WNT5A信號(hào)通路調(diào)控骨肉瘤細(xì)胞遷移和侵襲的機(jī)制研究3.2 SRC 激酶在 WNT5A 促進(jìn) MG-63 細(xì)胞遷移和侵襲中的作用。為了確認(rèn) SRC 是否能夠被 WNT5A 激活，以時(shí)間依賴的方式（0、1、5、15、30 和 60 min）將 MG-63 細(xì)胞暴露于 WNT5A（100 ng/ml）中。然后，使用蛋白免疫印跡法檢測(cè) SRC 在 Tyr416 位點(diǎn)的磷酸化水平（p-Tyr416 SRC，即 SRC 的激活狀態(tài)）。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，SRC 的磷酸化水平在 1 分鐘內(nèi)迅速增加，并在 5 分鐘時(shí)達(dá)到峰值（見圖 2A，2B）。接下來(lái)，我們使用蛋白免疫印跡法來(lái)檢測(cè) SRC siRNA 的沉默效率。與對(duì)照組和 non-silencing siRNA 組相比，SRC siRNA 轉(zhuǎn)染組細(xì)胞的 SRC 的表達(dá)水平顯著下降（見圖 3A，3B）。WNT5A 在 SRC siRNA 轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中不能明顯地促進(jìn)SRC 的活化（見圖 5A，5C）。而且我們發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，SRC siRNA 轉(zhuǎn)染可導(dǎo)致 MG-63 細(xì)胞遷移和侵襲能力的下降，并顯著抑制由 WNT5A 引起的遷移和侵襲作用（見圖 5G 5I）。

WNT5A信號(hào)通路調(diào)控骨肉瘤細(xì)胞遷移和侵襲WNT5A 對(duì) ERK1/2 的磷酸化作用被 PD98059 以劑量依0 μM 的 PD98059 顯著抑制 ERK1/2 的磷酸化（見圖 4A明ERK1/2參與到WNT5A誘導(dǎo)的MG-63細(xì)胞的遷移和處理 MG-63 細(xì)胞，然后加入 WNT5A。結(jié)果顯示，與顯抑制了細(xì)胞的遷移（見圖 5G，5H）和侵襲（見圖 NT5A 誘導(dǎo)的遷移和侵襲（見圖 5G-5I）。

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 ;Wnt5a participates in hepatic stellate cell activation observed by gene expression profile and functional assays[J];World Journal of Gastroenterology;2012年15期

本文編號(hào)：2800235