【摘要】：第一部分:黑色素納米光聲分子探針的制備和表征背景:光聲成像是一種新興、無創(chuàng)傷的生物醫(yī)學(xué)成像模式,擁有高分辨率和高對比度,目前已廣泛應(yīng)用于疾病的影像學(xué)實(shí)驗(yàn)研究。然而,在大多數(shù)疾病的病理生理過程中,缺少內(nèi)源性體現(xiàn)病理變化的光聲造影物質(zhì)。我們設(shè)計(jì)由多聚賴氨酸修飾天然的黑色素納米粒子合成的光聲分子探針,表面富含豐富的正電荷,能夠與軟骨基質(zhì)中的GAGs靶向結(jié)合,從而量化軟骨退變過程中GAGs含量變化。實(shí)驗(yàn)第一部分目的即制備富含正電荷的新型納米黑色素光聲探針并對其進(jìn)行表征及鑒定。方法:水溶性黑色素納米顆粒的制備:取黑色素顆粒溶解于0.1N的NaOH水溶液中,超聲條件下(輸出功率=10W)震蕩,得到明亮的黑色素水溶液。用0.1N的HC1水溶液將其pH值調(diào)制中性(PH=7),過濾器過濾,用去離子水反復(fù)沖洗去除產(chǎn)生的氯化鈉,將獲得的黑色素水溶劑凍干,得到超細(xì)黑色素納米顆粒MNP。MNP與多聚賴氨酸PLL的連接:將多聚賴氨酸加入到已準(zhǔn)備好的MNP水溶液中攪拌、混勻,過夜,MNP通過靜電吸引力作用被PLL包裹;次日,蒸餾法洗滌三次,獲得光聲分子探針PLL-MNPs。探針的表征及鑒定:在PBS溶液中測試探針的水溶性;在四氫呋喃中測試探針的紫外吸收光譜;在PBS溶液中測試溶液穩(wěn)定性；Zeta電位分析儀測定探針的電位;激光照射檢測材料的光穩(wěn)定性;應(yīng)用光聲成像系統(tǒng)測試探針光聲特性,繪制光聲光譜曲線。用MTT法評(píng)估PLL-MNPs的細(xì)胞毒性。結(jié)果:成功合成了 PLL-MNPs納米光聲探針。納米顆粒呈棕黑色,水溶性良好,溶解度可達(dá)到5 mg/ml,水合粒徑穩(wěn)定42.5 ±1.6 nm,并可在水溶液中長期保存,無聚集和沉淀。PLL-MNPs光聲探針在水溶液中近紅外吸收較寬,我們?nèi)?80 nm作為本實(shí)驗(yàn)光聲激發(fā)波長。Zeta電位分析儀測定MNPs的Zeta電位為-22.2 ± 12.1 mv,而我們合成的PLL-MNPs的電位為+32.5 ± 9.3 mV。PLL-MNPs探針溶液暴露在680 nm波長的激光照射下(8 mJ/cm2),在各時(shí)間點(diǎn)紫外-可見光-近紅外光學(xué)下吸收光譜圖中,我們可以看到光聲探針的吸收幾乎沒有減弱,說明PLL-MNPs光穩(wěn)定性良好。細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)顯示經(jīng)不同濃度PLL-MNPs孵育24及48小時(shí)細(xì)胞成活率均保持在90%以上。結(jié)論:我們成功制備了富含大量正電荷的光聲分子探針PLL-MNPs,它水溶性良好,易修飾,具有良好的光學(xué)穩(wěn)定性、生物相容性以及良好的光聲特性等優(yōu)點(diǎn),是一種優(yōu)異的光聲成像材料。第二部分:PLL-MNPs光聲探針的軟骨體外靶向結(jié)合力、敏感性和特異性評(píng)價(jià)目的:通過軟骨體外實(shí)驗(yàn),探討PLL-MNPs光聲探針對軟骨GAGs靶向結(jié)合能力及對軟骨退變中GAGs含量變化監(jiān)測的敏感性和特異性。方法:取大鼠新鮮膝關(guān)節(jié)軟骨作為體外實(shí)驗(yàn)軟骨樣品,設(shè)置探針及對照組:PLL-MNPs組,MNPs組,Blocking組及PBS組。Blocking組中采用帶有正電荷的PLL作為競爭阻斷材料,PLL溶液孵育軟骨3小時(shí)后加入PLL-MNPs光聲探針進(jìn)行孵育。在攝取實(shí)驗(yàn)中,軟骨在96孔板透明板內(nèi)孵育各組探針,在不同的孵育時(shí)間(0～72小時(shí))獲得孵育樣品并用PBS洗凈,置入凝膠中進(jìn)行光聲測試,計(jì)算平均光聲信號(hào)值。滯留實(shí)驗(yàn)中,軟骨組織塊按上述步驟孵育各組探針,然后浸入到PBS溶液中,在不同浸泡時(shí)間點(diǎn)(0,1,2,4,12,24,48,72小時(shí))取出軟骨樣本置入瓊脂糖凝膠中,進(jìn)行光聲檢測,記錄光聲信號(hào)強(qiáng)度值。軟骨退變分析實(shí)驗(yàn)中,軟骨樣品用硫酸軟骨素酶ABC溶液(0,0.1,0.3,和0.5 U/ml的50毫摩爾Tris,0.02%BSA和60毫摩爾醋酸鈉緩沖液,pH 8)在37℃處理24小時(shí),得到不同含量梯度GAGs的軟骨塊。經(jīng)不同電荷光聲探針(PLL-MNPs,MNPs)孵育24小時(shí),進(jìn)行光聲檢測,繪制光聲信號(hào)值和GAGs含量的相關(guān)曲線。結(jié)果:攝取實(shí)驗(yàn)顯示,富含正電荷的PLL-MNPs光聲探針具有更強(qiáng)的軟骨攝取能力。原始軟骨自身光聲信號(hào)值為200,經(jīng)探針孵育后24小時(shí),與MNPs組(1425 ±46)相比,PLL-MNPs展示了更強(qiáng)的光聲信號(hào)強(qiáng)度(2580 ±83);應(yīng)用阻斷劑預(yù)處理后,軟骨攝取PLL-MNPs的能力明顯減弱,證明了陽離子光聲探針對軟骨中帶負(fù)電的GAGs具有靶向結(jié)合能力。孵育后軟骨的光聲光譜分析結(jié)果與探針在溶液中的結(jié)果基本一致。滯留實(shí)驗(yàn)中,MNPs組24小時(shí)后光聲信號(hào)強(qiáng)度下降明顯,而PLL-MNPs組仍保持了超過50%的信號(hào)強(qiáng)度;同時(shí)PLL-MNPs與MNPs在24小時(shí)時(shí)間點(diǎn)上滯留比最高,為1.86。在軟骨退變分析實(shí)驗(yàn)中,PLL-MNPs孵育的正常關(guān)節(jié)軟骨光聲強(qiáng)度明顯大于經(jīng)軟骨酶處理后的軟骨,并且光聲信號(hào)強(qiáng)度與軟骨中GAGs濃度呈正相關(guān)(R2=0.83,p0.001);而MNPs組顯示的相關(guān)性沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(R2 = 0.38,p0.01);同時(shí),在光聲圖像中也可清晰區(qū)分正常軟骨與退變軟骨,表明了陽離子光聲探針PLL-MNPs能夠靈敏的檢測軟骨基質(zhì)中GAGs含量的變化。結(jié)論:通過一系列軟骨體外實(shí)驗(yàn)研究證實(shí),PLL-MNPs具有很強(qiáng)的軟骨攝取能力,同時(shí)也證實(shí)了與軟骨基質(zhì)中GAGs的特異靶向結(jié)合。更重要的是應(yīng)用PLL-MNPs光聲探針,能夠?qū)浌腔|(zhì)中GAGs含量變化進(jìn)行監(jiān)測,從而為下一步在體內(nèi)實(shí)現(xiàn)骨關(guān)節(jié)炎早期診斷的實(shí)驗(yàn)研究奠定了基礎(chǔ)。第三部分:PLL-MNPs光聲探針早期診斷骨關(guān)節(jié)炎軟骨退變的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究目的:利用小鼠骨關(guān)節(jié)炎模型,在體內(nèi)驗(yàn)證PLL-MNPs光聲探針早期診斷骨關(guān)節(jié)炎關(guān)節(jié)軟退變及其鑒別不同時(shí)期骨關(guān)節(jié)炎的有效性。方法:通過調(diào)整成像參數(shù)及擺放動(dòng)物體位應(yīng)用光聲成像系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)對膝關(guān)節(jié)的活體解剖成像;采用切斷板脛韌帶手術(shù)致內(nèi)側(cè)半月板不穩(wěn)誘導(dǎo)的方法建立小鼠OA模型;首先取術(shù)后4周作為早期軟骨退變模型,關(guān)節(jié)腔注射光聲探針及各對照組探針,通過光聲圖像觀察及光聲信號(hào)強(qiáng)度量化分析驗(yàn)證PLL-MNPs在骨關(guān)節(jié)炎早期軟骨退變診斷的有效性。對造模術(shù)后4周骨關(guān)節(jié)炎模型分別行X線、MRI及PAI成像,評(píng)價(jià)各種成像模態(tài)早期診斷的有效性;對造模術(shù)后4周及8周的動(dòng)物模型進(jìn)行PAI檢查,評(píng)估PLL-MNPs鑒別不同時(shí)期骨關(guān)節(jié)炎軟骨退變的有效性。每一階段實(shí)驗(yàn)結(jié)束后對模型標(biāo)本施行病理檢查,驗(yàn)證軟骨退變及GAGs含量的變化。膝關(guān)節(jié)腔局部注射PLL-MNPs光聲探針,應(yīng)用大體觀察及HE染色病理學(xué)檢查檢測探針的體內(nèi)毒性。結(jié)果:首次應(yīng)用光聲成像系統(tǒng)對小鼠膝關(guān)節(jié)實(shí)現(xiàn)較清晰的解剖成像。應(yīng)用切斷板脛韌帶手術(shù)誘導(dǎo)方法成功得到早期骨關(guān)節(jié)炎模型;經(jīng)關(guān)節(jié)腔注射PLL-MNPs后,正常關(guān)節(jié)注射3小時(shí)后出現(xiàn)光聲探針的聚集,表現(xiàn)為信號(hào)明顯增強(qiáng),而關(guān)節(jié)炎側(cè)關(guān)節(jié)信號(hào)增強(qiáng)不明顯(1441 ±109 vs.2113 ±103,p0.01)。同時(shí)PLL-MNPs在正常關(guān)節(jié)的滯留時(shí)間明顯長于關(guān)節(jié)炎側(cè)關(guān)節(jié)。作為探針對照組,MNPs與PBS組在兩類關(guān)節(jié)中信號(hào)強(qiáng)度無明顯差異。對比分析傳統(tǒng)X線及MRI檢查,X線在早期骨關(guān)節(jié)炎中無明顯異常表現(xiàn);MRI可以觀察到骨關(guān)節(jié)炎病變關(guān)節(jié)中關(guān)節(jié)積液,但未發(fā)現(xiàn)軟骨出現(xiàn)形態(tài)學(xué)病變;而經(jīng)PLL-MNPs增強(qiáng)的光聲成像可以清晰的區(qū)分早期軟骨退變關(guān)節(jié)與正常關(guān)節(jié)GAGs含量的不同,從而實(shí)現(xiàn)早期診斷。在不同時(shí)期骨關(guān)節(jié)炎的鑒別中,造模術(shù)后4周的關(guān)節(jié)光聲信號(hào)強(qiáng)度明顯強(qiáng)于術(shù)后8周的關(guān)節(jié)(1454 ± 127,1036 ± 55,p ＜ 0.01)。以上實(shí)驗(yàn)最終都獲得了病理結(jié)果的驗(yàn)證。對探針體內(nèi)毒性進(jìn)行進(jìn)一步檢測發(fā)現(xiàn),經(jīng)關(guān)節(jié)腔局部注射3天后膝關(guān)節(jié)未發(fā)現(xiàn)明顯破壞及其他病理改變。關(guān)節(jié)腔注射PLL-MNPs光聲探針3天后對主要臟器進(jìn)行病理學(xué)檢查,檢查結(jié)果提示各臟器未見明顯損傷及炎癥改變。結(jié)論:本部分實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明PLL-MNPs光聲探針在活體內(nèi)能夠高效、精準(zhǔn)靶向關(guān)節(jié)軟骨GAGs,通過檢測GAGs含量變化實(shí)現(xiàn)了骨關(guān)節(jié)炎軟骨退變的早期診斷,并能夠?qū)Σ煌瑫r(shí)期骨關(guān)節(jié)炎軟骨退變進(jìn)行鑒別,敏感性較高,實(shí)現(xiàn)了對骨關(guān)節(jié)炎病情進(jìn)展的觀察和預(yù)測。此外,PLL-MNPs生物相容性好且體內(nèi)毒性低,具有很好的臨床轉(zhuǎn)化前景。
【學(xué)位授予單位】：武漢大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R684.3
【圖文】：

逑３．２邐ＰＬＬ－ＭＮＰｓ的物理特性逡逑如圖３所示，所制備的ＰＬＬ－ＭＮＰｓ光聲探針為棕黑色懸液，靜置后無分層逡逑現(xiàn)象。室溫條件下，密封后長時(shí)間放置能保持較好的分散性，無沉淀產(chǎn)生。逡逑ＡＳＫ．逡逑■逡逑屋逡逑圖３制備好的ＰＬＬ－ＭＮＰｓ在ＰＢＳ}槌逡海ǎ校儒澹藉澹罰矗┲械耐計(jì)�。辶x希常沖危校蹋蹋停危校笥耄停危校竽擅琢Ｗ擁謀碚麇義賢干淶緹低枷襠希停危校竽擅卓帕３是蛐危笮【齲礱嫫交暾�，颗粒辶x戲稚ⅲ蘧奐橢氐�。靶向虚喩米颗粒ＰＬＬ－ＭＮＰｓ形态结构与ＭＮＰｓ纳米颗辶x狹；疽恢?jǐn)nㄍ跡矗幔�，大小均札x礱嫫交暾帕７稚⑿粵己�，无緤J橢劐義系唬模蹋詠峁允荊停危校竽擅琢Ｗ恿＞段擔(dān)稿

本文編號(hào)：2800035