【摘要】：ALI/ARDS是由多種致病誘因引發(fā)的,以進(jìn)行性呼吸困難和頑固性低氧血癥為主要特征的機(jī)體急性過度炎癥反應(yīng)綜合征。近年來,由于空氣污染及人類生活習(xí)慣的轉(zhuǎn)變,ALI/ARDS的發(fā)病率日趨增高,是嚴(yán)重創(chuàng)傷、重癥感染、手術(shù)麻醉等多種臨床案例的并發(fā)癥。ALI已嚴(yán)重影響患者呼吸系統(tǒng)、生活質(zhì)量甚至危及生命,因此ALI患者應(yīng)及時(shí)進(jìn)行機(jī)械通氣治療。研發(fā)抗急性肺損傷藥物,提升病患生活質(zhì)量,降低患者死亡率,成為亟待解決而任重道遠(yuǎn)的課題。ALI本質(zhì)上是呼吸道及肺組織中的失控性炎癥反應(yīng)。在急性肺損傷的最初炎癥病理反應(yīng)階段,革蘭陰性細(xì)菌感染是常見的致病因素。脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)是ICU、手術(shù)室中發(fā)生感染的常見致病因素。LPS的滴鼻誘導(dǎo)可有效模擬急性肺損傷的發(fā)病過程,是廣泛應(yīng)用的動(dòng)物模型。LPS可刺激多種炎性細(xì)胞,致使大量炎癥介質(zhì)釋放,加速ALI病情的惡化。故遏制炎性細(xì)胞過度激活及炎癥因子的釋放是改善ALI/ARDS病情發(fā)展的關(guān)鍵。右美托咪定已廣泛應(yīng)用于ICU和臨床麻醉工作。大量證據(jù)表明右美托咪定能夠緩解急性肺損傷病情,但其作用機(jī)制尚不完全清楚。高遷移率族蛋白1(high mobility group box-l protein,HMGBl)是高遷移率族(HMG)蛋白家族成員,能夠參與多種下游靶標(biāo)和基因轉(zhuǎn)錄過程的調(diào)控。HMGBl起到炎癥反應(yīng)的樞紐作用。甘草酸(Glycyrrhizin)是中藥甘草中提取的主要有效成分,也是常用的HMGBl天然抑制劑,本課題擬以右美托咪定為研究對(duì)象,采用動(dòng)物模型及體外不同種屬來源細(xì)胞模型,闡述HMGBl介導(dǎo)的TLR4/MyD88/NF-κB通路和PI3K/Akt/mTOR通路在急性肺損傷發(fā)病進(jìn)程中的調(diào)節(jié)作用與機(jī)制。1.右美托咪定對(duì)LPS誘導(dǎo)大鼠急性肺損傷的保護(hù)作用目的:本章旨在從抗炎和抗氧化途徑探究右美托咪定對(duì)LPS致大鼠急性肺損傷的保護(hù)作用及機(jī)制。方法:隨機(jī)將SD大鼠分為正常對(duì)照組、LPS組、LPS+地塞米松(Dexamethasone,DXM,2 mg/kg)組、LPS+DEX(12.5μg/kg)組、LPS+DEX(50μg/kg)組和LPS+DEX(50μg/kg)+甘草酸(Glycyrrhizin)組。給SD大鼠連續(xù)3天腹腔注射DXM(2mg/kg)或DEX(12.5μg/kg,50μg/kg),正常對(duì)照組和LPS組同時(shí)腹腔注射給予等體積溶媒。1 h后給LPS+DEX(50μg/kg)+甘草酸組大鼠腹腔注射甘草酸(50mg/kg)。在甘草酸組注射結(jié)束1h后,滴鼻給予200μl LPS(8 mg/ml)構(gòu)建急性肺損傷模型,正常對(duì)照組同時(shí)滴鼻給予200μl PBS,6 h后處死大鼠�？疾旆谓M織中過氧化物酶(MPO)活性,血清中丙二醛(MDA)含量和超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)的活力;用ELISA試劑盒測(cè)定BALF、血清和肺組織中炎癥因子白介素(IL)-6、IL-1β及腫瘤壞死因子(TNF)-α的水平;HE染色觀察肺組織的病理變化;應(yīng)用免疫組化分析肺組織中HMGB1的表達(dá)以及用western blot法檢測(cè)TLR4、MyD88、IκBα、p-IκBα、NF-κB、p-NF-κB、PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt、mTOR和p-mTOR的變化。結(jié)果:DEX顯著緩解了LPS刺激所引起的肺組織病理學(xué)改變,并且降低了大鼠BALF、血清和肺組織中IL-6、IL-1β及TNF-α的含量,提高血清中SOD、GSH-Px的活性,降低MPO活力和MDA含量。通過Western blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)DEX能明顯下調(diào)肺組織中HMGB1、TLR4、MyD88、p-IκBα、p-NF-κB、p-PI3K、p-Akt和p-mTOR的表達(dá)。免疫組化染色結(jié)果亦顯示DEX明顯下調(diào)HMGB1表達(dá)。同時(shí),通過HMGB1抑制劑甘草酸的應(yīng)用證實(shí)了DEX改善急性肺損傷的作用機(jī)制與HMGB1通路有關(guān)。結(jié)論:DEX可以通過抗炎和抗氧化效應(yīng)有效改善LPS誘導(dǎo)的大鼠急性肺損傷,其作用機(jī)制可能與HMGB1介導(dǎo)的TLR4/NF-κB和PI3K/Akt/mTOR通路相關(guān)。2.右美托咪定對(duì)LPS誘導(dǎo)人支氣管上皮細(xì)胞BEAS-2B的保護(hù)作用目的:本章旨在研究右美托咪定對(duì)LPS誘導(dǎo)人支氣管上皮細(xì)胞BEAS-2B的保護(hù)作用并探究其機(jī)制。方法:BEAS-2B細(xì)胞被隨機(jī)分為7組:正常對(duì)照組,LPS組,LPS+glycyrrhizin組,LPS+DEX(5μM)組,LPS+DEX(10μM)group組,LPS+DEX(20μM)group組和LPS+DEX(20μM)+glycyrrhizin組。細(xì)胞用DEX(5,10,and 20μM)進(jìn)行預(yù)處理1小時(shí),細(xì)胞與glycyrrhizin(20μM)再孵育1小時(shí)后加入LPS(4μg/ml)。24小時(shí)后,收集細(xì)胞和上清液進(jìn)行檢測(cè)。Griess法檢測(cè)NO含量;MTT法檢測(cè)細(xì)胞活力;ELISA法檢測(cè)細(xì)胞上清液中IL-1β、IL-6和TNF-α含量;檢測(cè)細(xì)胞中SOD和GSH-Px活性以及MDA含量;Western blot法檢測(cè)細(xì)胞中HMGB1、TLR4、MyD88、IκBα、p-IκBα、NF-κB、p-NF-κB、PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt、mTOR和p-mTOR的表達(dá);免疫熒光分析細(xì)胞中HMGB1的表達(dá)情況。結(jié)果:DEX(5,10,and 20μM)能顯著抑制NO生成;減少上清液中IL-1β、IL-6和TNF-α水平;降低了MDA含量,增強(qiáng)了SOD和GSH-Px的活性。DEX能有效下調(diào)HMGB1、TLR4和MyD88的表達(dá),抑制IκBα、NF-κB、PI3K、Akt和mTOR磷酸化;DEX聯(lián)合HMGB1抑制劑甘草酸作用時(shí)抑制作用更顯著。免疫熒光染色結(jié)果亦顯示DEX能明顯抑制BEAS-2B中HMGB1的表達(dá)。結(jié)論:DEX可能通過HMGB1介導(dǎo)的TLR4/NF-κB和PI3K/Akt/mTOR通路對(duì)LPS誘導(dǎo)BEAS-2B細(xì)胞有較好的抗炎、抗氧化效應(yīng)。3.右美托咪定對(duì)LPS誘導(dǎo)大鼠肺泡巨噬細(xì)胞NR8383的保護(hù)作用目的:本章旨在評(píng)估右美托咪定對(duì)LPS誘導(dǎo)大鼠肺泡巨噬細(xì)胞NR8383的保護(hù)效應(yīng)并探究其機(jī)理。方法:NR8383被隨機(jī)分為7組:正常對(duì)照組,LPS組,LPS+glycyrrhizin組,LPS+DEX(2μM)組,LPS+DEX(4μM)組,LPS+DEX(8μM)組和LPS+DEX(8μM)+glycyrrhizin組。細(xì)胞用DEX(2,4,and 8μM)進(jìn)行預(yù)處理1小時(shí),細(xì)胞與glycyrrhizin再孵育1小時(shí)后加入LPS(2μg/ml)。24小時(shí)后,收集細(xì)胞和上清液進(jìn)行檢測(cè)。Griess法檢測(cè)NO含量;MTT法檢測(cè)細(xì)胞活力;ELISA法檢測(cè)細(xì)胞上清液中IL-1β、IL-6和TNF-α含量;檢測(cè)細(xì)胞中SOD和GSH-Px活性以及MDA含量;Western blot法檢測(cè)細(xì)胞中HMGB1、TLR4、MyD88、IκBα、p-IκBα、NF-κB、p-NF-κB、PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt、mTOR和p-mTOR的表達(dá);免疫熒光分析細(xì)胞中HMGB1的表達(dá)情況。結(jié)果:DEX(2,4,and 8μM)能顯著抑制NO生成;減少上清液中IL-1β、IL-6和TNF-α水平;降低了MDA含量,增強(qiáng)了SOD和GSH-Px的活性。DEX能有效下調(diào)HMGB1、TLR4和MyD88的表達(dá),抑制IκBα、NF-κB、PI3K、Akt和mTOR磷酸化;DEX聯(lián)合HMGB1抑制劑甘草酸作用時(shí)下調(diào)和抑制作用更顯著。結(jié)論:DEX可能通過HMGB1介導(dǎo)的TLR4/NF-κB和PI3K/Akt/mTOR通路對(duì)LPS誘導(dǎo)NR8383細(xì)胞有較好的抗炎、抗氧化效應(yīng)。本實(shí)驗(yàn)從體內(nèi)體外較為系統(tǒng)的研究了右美托咪定(DEX)對(duì)LPS誘導(dǎo)大鼠急性肺損傷、LPS誘導(dǎo)人肺上皮細(xì)胞BEAS-2B、LPS誘導(dǎo)大鼠肺泡巨噬細(xì)胞NR8383等三個(gè)模型的藥理作用。機(jī)制研究結(jié)果提示右美托咪定的抗炎抗氧化效應(yīng)可能與HMGB1調(diào)控的TLR4/NF-κB和PI3K/Akt/mTOR通路有關(guān)。
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R614
【圖文】：

前 言應(yīng), 并通過右美托咪定對(duì)體外不同種屬來源細(xì)胞的作用研究, 進(jìn)一步探其對(duì)急性肺損傷保護(hù)作用的抗炎抗氧化分子機(jī)制。 以期為深入了解右的作用機(jī)理及后續(xù)新藥開發(fā)提供實(shí)驗(yàn)參考。

圖 2.1 右美托咪定對(duì)LPS誘導(dǎo)肺組織W/D 比例及BALF中嗜中性粒細(xì)胞、總細(xì)胞數(shù)量的影響。與正常對(duì)照組相比,##p<0.01,###p<0.001;與 LPS 組相比, *p<0.05,**p<0.01, ***p<0.001。Fig 2.1 The effect of DEX on pulmonary W/D ratio, the number of neutrophilsand total cells in BALF.##p<0.01,###p<0.001 vs control group; *p<0.05, **p<0.01,***p<0.001 vs LPS group.2.3.2 右美托咪定對(duì) LPS 誘導(dǎo)大鼠肺組織 MPO 活力的影響我們檢測(cè)了肺組織中 MPO 活力來評(píng)估炎性細(xì)胞的浸潤(rùn)和遷移程度。結(jié)果如圖 2.2 所示, 與正常對(duì)照組相比, LPS 組大鼠肺組織中的 MPO 活性明顯增強(qiáng)(p＜0.001)。與 LPS 組相比, DXM 組和 DEX(50 μg/kg)組大鼠肺組織中的 MPO 活性顯著下降(p＜0.05), 而DEX(50 μg/kg) + glycyrrhizin組具有更強(qiáng)的降低MPO水平的能力(p＜0.01)。

圖 2.2 右美托咪定對(duì) LPS 誘導(dǎo)大鼠肺組織 MPO 活力的影響。與正常對(duì)照組相比,###p<0.001;與 LPS 組相比, *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001。Fig 2.2 The effect of DEX on pulmonary MPO activity.###p<0.001 vs controlgroup; *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001 vs LPS group.2.3.3 右美托咪定對(duì) LPS 誘導(dǎo)大鼠肺組織病理?yè)p傷的影響用 H&E 染色評(píng)價(jià) DEX 對(duì)肺部病理?yè)p傷的保護(hù)效果。如圖 2.3 所示, 正常對(duì)照組肺組織結(jié)構(gòu)完整, 肺泡壁無(wú)充血, 肺泡腔清晰, 肺泡間隔內(nèi)無(wú)水腫及炎性細(xì)胞的浸潤(rùn)。與正常對(duì)照組相比, LPS 組肺泡腔變小, 肺泡間隔增厚, 肺泡壁充血水腫, 且有大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。與 LPS 組相比, DXM 組和 DEX(50 μg/kg)組大鼠肺組織結(jié)構(gòu)趨于正常、炎性細(xì)胞浸潤(rùn)得以緩解, 而 DEX(50 μg/kg) + glycyrrhizin組保護(hù)作用優(yōu)于 DXM 組或 DEX(50 μg/kg)組。

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2799416