發(fā)布時(shí)間：2020-08-18 07:59

【摘要】：背景軟骨肉瘤是由軟骨細(xì)胞異常增生形成的異質(zhì)性腫瘤,美國每年約有600人發(fā)病。發(fā)病率在骨腫瘤中僅次于骨肉瘤,以臨床普遍放化療耐藥聞名。手術(shù)切除作為軟骨肉瘤治療中的主要手段,晚期腫瘤轉(zhuǎn)移及侵襲則往往導(dǎo)致此類腫瘤患者的不良預(yù)后。新型藥物研發(fā)或?yàn)檐浌侨饬龌颊叩闹委熖峁┬碌牟呗�。DNA甲基化作為三大表觀遺傳學(xué)機(jī)制之一,參與調(diào)控諸多腫瘤相關(guān)基因(如抑癌基因WIF1),并已在多種癌癥中證實(shí)。然而,甲基化對WIF1的修飾改變在軟骨肉瘤中卻仍未報(bào)道。方法1.流行病學(xué)方法為回顧性實(shí)驗(yàn)分析,納入美國麻省總醫(yī)院(Massachusetts General Hosptial,MGH)癌癥登記管理中心和骨腫瘤數(shù)據(jù)庫45例軟骨肉瘤標(biāo)本。軟骨肉瘤臨床標(biāo)本組織學(xué)分類及分型均由MGH病理科醫(yī)生負(fù)責(zé),臨床數(shù)據(jù)按年齡、性別、組織學(xué)類型、腫瘤分級、腫瘤部位、轉(zhuǎn)移情況、復(fù)發(fā)情況、疾病狀態(tài)和死亡時(shí)間分類。2.采用實(shí)時(shí)定量PCR(qPCR)技術(shù)測定WIF1的DNA甲基化水平。3.采用Western-blot測定WIF1以及下游Wnt通路(Wnt5a/b、LRP6和Dvl2)蛋白表達(dá)水平。4.運(yùn)用Kaplan-Meier生存曲線、log-rank分析及Cox多元回歸分析研究WIF1甲基化與軟骨肉瘤預(yù)后相關(guān)性。結(jié)果1.軟骨肉瘤細(xì)胞系CS-1與SW1353中WIF1甲基化水平分別為97.33%與96.22%。2.通過Western-blot測定,證實(shí)了WIF1低蛋白表達(dá)以及其下游Wnt通路蛋白(Wnt5a/b、LRP6和Dvl2)的相對表達(dá)激活狀態(tài)。3.共入45例軟骨肉瘤患者,最終通過qPCR CT值質(zhì)量控制43例,甲基化水平分部如下:平均數(shù)為46.61;中位數(shù)60.13;標(biāo)準(zhǔn)差(SD)39.92;范圍0.00-99.54。4.隨訪資料示:17例(40%)死于疾病且中位隨訪時(shí)間為25個(gè)月;整體隨訪時(shí)間平均為57.63月,區(qū)間范圍1至234個(gè)月。Kaplan-Meier生存曲線及l(fā)og-rank分析均顯示W(wǎng)IF1高甲基化水平與軟骨肉瘤低生存預(yù)后(總生存期與無進(jìn)展生存期)相關(guān)(p＜0.05)。Cox多元回歸分析再次印證了測定WIF1基因甲基化水平可獨(dú)立作為評估OS與PFS的預(yù)后指標(biāo)(p＜0.05)。結(jié)論1.在軟骨肉瘤細(xì)胞系中,WIF1基因啟動子區(qū)的異常甲基化修飾可下調(diào)WIF1蛋白表達(dá)并且導(dǎo)致下游Wnt信號通路的異常激活傳導(dǎo)。2.臨床標(biāo)本研究中,WIF1高甲基化水平與軟骨肉瘤患者的較短無進(jìn)展生存期以及總生存期相關(guān)。WIF1啟動子甲基化水平可作為軟骨肉瘤患者的獨(dú)立預(yù)后預(yù)測因素。3.進(jìn)一步的機(jī)制學(xué)研究或可為靶向Wnt信號傳導(dǎo)通路提供新型的軟骨肉瘤治療策略。
【學(xué)位授予單位】：鄭州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R738.1
【圖文】：

結(jié) 果1 軟骨肉瘤細(xì)胞系中 WIF1 啟動子甲基化分析本研究檢測了軟骨肉瘤細(xì)胞系 CS-1 與 SW1353 中 WIF1 啟動子甲基化水平（圖 1A）。我們之所以選擇 WIF1 基因作為研究對象主要因?yàn)槠湓诙喾N惡性腫瘤中參與腫瘤發(fā)生發(fā)展的確定性，然而，WIF1 基因甲基化并未在軟骨肉瘤中報(bào)道（補(bǔ)充表 1）。代表性的細(xì)胞系 WIF1 擴(kuò)增曲線示于圖 1B。我們發(fā)現(xiàn) CS-1 中 WIF啟動子甲基化水平為 97.33%而 SW1353 中為 96.22%（圖 1C）。22 腫瘤相關(guān)基因甲基化水平于 CS-1 中分布為 0.51%至 98.81%；SW1353 中分布為 0.05%-99.61%

DNA 總量（背景信號）。X 軸為實(shí)時(shí)定量 PCR 循環(huán)數(shù)，Y 軸為熒光信號強(qiáng)度。（C系中的 WIF1 甲基化水平。WIF1 基因在 CS 細(xì)胞中發(fā)生高頻率甲基化修飾：CS-1 中3%；UM，2.67%）；SW1353 中（M，96.22%；UM，3.78%）。M 表示甲基化，U甲基化。NA 甲基化沉默 WIF1 表達(dá)并加強(qiáng) Wnt 信號傳導(dǎo)通路由于證實(shí) WIF1 在軟骨肉瘤中的發(fā)生啟動子甲基化修飾，蛋白印記實(shí)驗(yàn)步探究 WIF1 的蛋白表達(dá)水平。正如我們所期望的，WIF1 在未加入抗物前，在 CS-1 與 SW1353 細(xì)胞系中均呈現(xiàn)低水平表達(dá)甚至缺失表達(dá)（圖度加入甲基化抑制藥物 5-Aza-dC 進(jìn)行去甲基進(jìn)程后，WIF1 的蛋白表了梯度性的回升（圖 2）。蛋白印記實(shí)驗(yàn)的定量分析顯示 5-Aza-dC 可F1 蛋白水平表達(dá)，并呈現(xiàn)劑量依賴型相關(guān)性。另外，我們進(jìn)一步發(fā)現(xiàn) 控 Wnt 信號通路在軟骨肉瘤細(xì)胞系中的傳導(dǎo)。結(jié)果顯示當(dāng) WIF1 去甲后，導(dǎo)致下游 Wnt5a/b、LRP6 以及 Dvl2 在軟骨肉瘤細(xì)胞系中的遞減蛋平（圖 2）。綜上所述，以上結(jié)果表明 WIF1 的 DNA 甲基化修飾可激活在軟骨肉瘤細(xì)胞中的傳導(dǎo)。

13圖 3 WIF1 在 CS 組織標(biāo)本中的甲基化水平(A)各個(gè)標(biāo)本中 WIF1 甲基化水平展示。（B）43 例 CS 腫瘤標(biāo)本分布展示。4 WIF1 甲基化與軟骨肉瘤患者預(yù)后分析我們接下來分析了 WIF1 甲基化與患者預(yù)后相關(guān)性。43 例軟骨肉瘤中，1例（40%）死于疾病且中位隨訪時(shí)間為 25 個(gè)月；整體隨訪時(shí)間平均為 57.63 月

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 魏慧君;房念珍;郭麗麗;吳志浩;周清華;;RASSF1A基因啟動子甲基化與非小細(xì)胞肺癌關(guān)系的meta分析[J];中國肺癌雜志;2015年07期

本文編號：2795955