【摘要】：背景部分肝切除手術(shù)(PHx)是原發(fā)性肝癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)和肝硬化等終末期肝臟疾病常用的治療手段。部分肝切除手術(shù)后,機(jī)體的代謝反應(yīng)會(huì)發(fā)生明顯的改變以適應(yīng)術(shù)后肝再生的能量需求。過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體α(PPARα)是以調(diào)節(jié)脂肪酸氧化為主要功能的核受體,同時(shí),很多研究也表明PPARα也是潛在的促有絲分裂因子。盡管已有報(bào)道顯示整體敲除PPARα基因后可減弱PHx后的肝再生能力,但是其具體作用機(jī)制仍不明確,我們之前的研究表明特異性敲除肝細(xì)胞的PPARα可抵消PPARα激動(dòng)劑Wy14643誘導(dǎo)的細(xì)胞增殖效應(yīng),而敲除髓樣細(xì)胞PPARα則沒(méi)有類似作用,這提示機(jī)體不同細(xì)胞上PPARα的表達(dá)對(duì)肝再生的影響是不同的,本課題擬應(yīng)用肝細(xì)胞特異性敲除PPARα小鼠,研究肝細(xì)胞PPARα在PHx誘導(dǎo)肝再生中作用,并探討其作用機(jī)制。目的研究肝細(xì)胞PPARα在PHx術(shù)后肝再生中的作用及其機(jī)制。方法1.采用肝細(xì)胞特異性PPARα敲除小鼠即Ppara~(△Hep)小鼠和同窩對(duì)照小鼠Ppara~(fl/fl)小鼠行2/3PHx手術(shù)。2.小鼠在取材前兩小時(shí)腹腔注射(5-Bromo-2-deoxyuridine,BrdU)(5 mg/ml,50mg/kg體重)使BrdU摻入增殖的細(xì)胞內(nèi),以便于后續(xù)的染色。取材后的肝組織固定于10%甲醛溶液中24小時(shí)后,進(jìn)行脫水和石蠟包埋,切片(4μm)后進(jìn)行BrdU染色。通過(guò)計(jì)算BrdU陽(yáng)性率(BrdU~+肝細(xì)胞數(shù)/肝細(xì)胞總數(shù))來(lái)比較不同組別小鼠肝臟再生的水平。3.部分石蠟切片用于蘇木精-伊紅(Hematoxylin and eosin,HE)染色對(duì)肝臟的病理改變進(jìn)行觀察。4.部分石蠟切片用于糖原PAS染色,對(duì)肝臟糖原含量的變化進(jìn)行檢測(cè)。5.留取部分肝組織進(jìn)行冰凍切片,通過(guò)油紅O染色檢測(cè)肝臟脂質(zhì)積累的情況。6.應(yīng)用實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)(q-PCR)對(duì)不同組別小鼠肝臟基因mRNA水平的變化進(jìn)行檢測(cè)。7.應(yīng)用蛋白免疫印記技術(shù)(Western blot,WB)定量檢測(cè)不同組別小鼠肝臟組織中與細(xì)胞增殖相關(guān)蛋白如增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)、細(xì)胞周期蛋白(Cyclin D1)及PPARα蛋白的表達(dá)情況。結(jié)果1.2/3肝切除模型構(gòu)建成功我們首先對(duì)WT小鼠進(jìn)行2/3肝切除手術(shù),在PHx后不同時(shí)間點(diǎn)取材,qPCR實(shí)驗(yàn)顯示PHx術(shù)后小鼠肝臟CyclinD1(Ccnd1)的mRNA水平在術(shù)后24、32和40h明顯高于Sham組小鼠。通過(guò)Brd U染色統(tǒng)計(jì)PHx-40h和Sham-40h BrdU陽(yáng)性率,該結(jié)果與已有報(bào)道一致,說(shuō)明2/3肝切除模型構(gòu)建成功。2.WT小鼠PHx后12和32 h肝臟PPARα的蛋白水平比Sham組明顯升高Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,與Sham組相比PHx術(shù)組小鼠在術(shù)后12和32h肝臟PPARα的蛋白水平明顯升高。3.肝細(xì)胞PPARα特異性敲除小鼠的敲除效率驗(yàn)證應(yīng)用qPCR和Western blot方法對(duì)肝細(xì)胞特異性PPARα敲除小鼠的敲除效率進(jìn)行驗(yàn)證,結(jié)果顯示敲除效率達(dá)90%以上,說(shuō)明轉(zhuǎn)基因小鼠敲除成功,符合實(shí)驗(yàn)要求。4.肝細(xì)胞PPARα特異性敲除小鼠PHx后肝再生能力減弱與Ppara~(fl/fl)小鼠相比,HE染色和BrdU免疫組化染色結(jié)果顯示PHx術(shù)后32小時(shí),Ppara~(△Hep)小鼠肝臟有絲分裂指數(shù)和BrdU陽(yáng)性率明顯降低,并且肝重/體重比在術(shù)后32 h也有明顯降低,提示肝臟PPARα可以促進(jìn)PHx后的肝細(xì)胞增殖。5.肝細(xì)胞PPARα特異性敲除小鼠PHx后細(xì)胞周期相關(guān)基因表達(dá)下降qPCR和Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,與對(duì)照組相比,PHx后12、24和32小時(shí)Ppara~(△Hep)小鼠Ccnd1的mRNA水平明顯降低;PHx后32小時(shí)Pcna的mRNA水平與對(duì)照組相比明顯降低。Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示CyclinD1和PCNA的蛋白水平變化趨勢(shì)與mRNA水平一致。6.肝細(xì)胞特異性敲除PPARα降低小鼠DNA損傷修復(fù)相關(guān)基因的表達(dá)q-PCR結(jié)果顯示PHx-24小時(shí),Ppara~(△Hep)小鼠DNA損傷修復(fù)相關(guān)基因,如Chek1,Mcm2/5,Prkdc和Rad51的mRNA水平與對(duì)照組相比明顯降低,說(shuō)明肝細(xì)胞PPARα對(duì)PHx后肝細(xì)胞DNA損傷的修復(fù)也起到了促進(jìn)作用。7.肝細(xì)胞特異性敲除PPARα促進(jìn)小鼠肝臟脂質(zhì)堆積肝臟油紅O染色和肝臟甘油三酯含量檢測(cè)結(jié)果均顯示Ppara~(△Hep)小鼠肝臟脂質(zhì)堆積增加,qPCR結(jié)果顯示PHx后6小時(shí)或12小時(shí),Ppara~(△Hep)小鼠肝臟脂肪酸氧化相關(guān)基因的表達(dá)較對(duì)照組也有明顯下降。8.肝細(xì)胞特異性敲除PPARα促進(jìn)小鼠肝臟糖原積累糖原PAS染色和肝臟糖原含量檢測(cè)結(jié)果顯示Ppara~(△Hep)小鼠肝臟糖原含量增加,伴隨著糖異生和糖酵解水平的降低。結(jié)論肝臟PPARα可通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞周期相關(guān)基因的表達(dá),增加肝臟脂質(zhì)代謝和葡萄糖代謝來(lái)滿足肝再生過(guò)程中大量的能量需求,進(jìn)而促進(jìn)肝再生。
【學(xué)位授予單位】：安徽醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R657.3

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2792472