【摘要】：背景部分肝切除手術(shù)(PHx)是原發(fā)性肝癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)和肝硬化等終末期肝臟疾病常用的治療手段。部分肝切除手術(shù)后,機體的代謝反應(yīng)會發(fā)生明顯的改變以適應(yīng)術(shù)后肝再生的能量需求。過氧化物酶體增殖物激活受體α(PPARα)是以調(diào)節(jié)脂肪酸氧化為主要功能的核受體,同時,很多研究也表明PPARα也是潛在的促有絲分裂因子。盡管已有報道顯示整體敲除PPARα基因后可減弱PHx后的肝再生能力,但是其具體作用機制仍不明確,我們之前的研究表明特異性敲除肝細胞的PPARα可抵消PPARα激動劑Wy14643誘導的細胞增殖效應(yīng),而敲除髓樣細胞PPARα則沒有類似作用,這提示機體不同細胞上PPARα的表達對肝再生的影響是不同的,本課題擬應(yīng)用肝細胞特異性敲除PPARα小鼠,研究肝細胞PPARα在PHx誘導肝再生中作用,并探討其作用機制。目的研究肝細胞PPARα在PHx術(shù)后肝再生中的作用及其機制。方法1.采用肝細胞特異性PPARα敲除小鼠即Ppara~(△Hep)小鼠和同窩對照小鼠Ppara~(fl/fl)小鼠行2/3PHx手術(shù)。2.小鼠在取材前兩小時腹腔注射(5-Bromo-2-deoxyuridine,BrdU)(5 mg/ml,50mg/kg體重)使BrdU摻入增殖的細胞內(nèi),以便于后續(xù)的染色。取材后的肝組織固定于10%甲醛溶液中24小時后,進行脫水和石蠟包埋,切片(4μm)后進行BrdU染色。通過計算BrdU陽性率(BrdU~+肝細胞數(shù)/肝細胞總數(shù))來比較不同組別小鼠肝臟再生的水平。3.部分石蠟切片用于蘇木精-伊紅(Hematoxylin and eosin,HE)染色對肝臟的病理改變進行觀察。4.部分石蠟切片用于糖原PAS染色,對肝臟糖原含量的變化進行檢測。5.留取部分肝組織進行冰凍切片,通過油紅O染色檢測肝臟脂質(zhì)積累的情況。6.應(yīng)用實時定量PCR技術(shù)(q-PCR)對不同組別小鼠肝臟基因mRNA水平的變化進行檢測。7.應(yīng)用蛋白免疫印記技術(shù)(Western blot,WB)定量檢測不同組別小鼠肝臟組織中與細胞增殖相關(guān)蛋白如增殖細胞核抗原(PCNA)、細胞周期蛋白(Cyclin D1)及PPARα蛋白的表達情況。結(jié)果1.2/3肝切除模型構(gòu)建成功我們首先對WT小鼠進行2/3肝切除手術(shù),在PHx后不同時間點取材,qPCR實驗顯示PHx術(shù)后小鼠肝臟CyclinD1(Ccnd1)的mRNA水平在術(shù)后24、32和40h明顯高于Sham組小鼠。通過Brd U染色統(tǒng)計PHx-40h和Sham-40h BrdU陽性率,該結(jié)果與已有報道一致,說明2/3肝切除模型構(gòu)建成功。2.WT小鼠PHx后12和32 h肝臟PPARα的蛋白水平比Sham組明顯升高Western blot實驗結(jié)果顯示,與Sham組相比PHx術(shù)組小鼠在術(shù)后12和32h肝臟PPARα的蛋白水平明顯升高。3.肝細胞PPARα特異性敲除小鼠的敲除效率驗證應(yīng)用qPCR和Western blot方法對肝細胞特異性PPARα敲除小鼠的敲除效率進行驗證,結(jié)果顯示敲除效率達90%以上,說明轉(zhuǎn)基因小鼠敲除成功,符合實驗要求。4.肝細胞PPARα特異性敲除小鼠PHx后肝再生能力減弱與Ppara~(fl/fl)小鼠相比,HE染色和BrdU免疫組化染色結(jié)果顯示PHx術(shù)后32小時,Ppara~(△Hep)小鼠肝臟有絲分裂指數(shù)和BrdU陽性率明顯降低,并且肝重/體重比在術(shù)后32 h也有明顯降低,提示肝臟PPARα可以促進PHx后的肝細胞增殖。5.肝細胞PPARα特異性敲除小鼠PHx后細胞周期相關(guān)基因表達下降qPCR和Western blot實驗結(jié)果顯示,與對照組相比,PHx后12、24和32小時Ppara~(△Hep)小鼠Ccnd1的mRNA水平明顯降低;PHx后32小時Pcna的mRNA水平與對照組相比明顯降低。Western blot實驗結(jié)果顯示CyclinD1和PCNA的蛋白水平變化趨勢與mRNA水平一致。6.肝細胞特異性敲除PPARα降低小鼠DNA損傷修復相關(guān)基因的表達q-PCR結(jié)果顯示PHx-24小時,Ppara~(△Hep)小鼠DNA損傷修復相關(guān)基因,如Chek1,Mcm2/5,Prkdc和Rad51的mRNA水平與對照組相比明顯降低,說明肝細胞PPARα對PHx后肝細胞DNA損傷的修復也起到了促進作用。7.肝細胞特異性敲除PPARα促進小鼠肝臟脂質(zhì)堆積肝臟油紅O染色和肝臟甘油三酯含量檢測結(jié)果均顯示Ppara~(△Hep)小鼠肝臟脂質(zhì)堆積增加,qPCR結(jié)果顯示PHx后6小時或12小時,Ppara~(△Hep)小鼠肝臟脂肪酸氧化相關(guān)基因的表達較對照組也有明顯下降。8.肝細胞特異性敲除PPARα促進小鼠肝臟糖原積累糖原PAS染色和肝臟糖原含量檢測結(jié)果顯示Ppara~(△Hep)小鼠肝臟糖原含量增加,伴隨著糖異生和糖酵解水平的降低。結(jié)論肝臟PPARα可通過調(diào)節(jié)細胞周期相關(guān)基因的表達,增加肝臟脂質(zhì)代謝和葡萄糖代謝來滿足肝再生過程中大量的能量需求,進而促進肝再生。
【學位授予單位】：安徽醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R657.3

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前4條

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本文編號：2792472