發(fā)布時間：2020-08-12 17:26

【摘要】：背景及目的:骨肉瘤(Osteosarcoma,OS)是一種高度惡性腫瘤,10%-20%患者確診時病灶已發(fā)生轉移。由于骨肉瘤轉移是一個復雜的病理過程,涉及到多種信號轉導途徑,因此,骨肉瘤高轉移、高侵襲特性相關機制是人們長期關注的課題。近年來,人們試圖通過探討上皮細胞-間充質(zhì)轉化(Epithelial mesenchymal transition,EMT)及其相關蛋白的作用,闡明惡性腫瘤轉移的機制。EMT是指上皮細胞通過特定程序轉化為具有間質(zhì)表型細胞的生物學過程,可導致細胞對細胞的連接的喪失,以及對一個移動和遷移表型的獲取,從而引起基底膜的侵入,最終可能導致轉移。骨肉瘤是間葉組織源性的最常見的骨惡性腫瘤。雖然,以往的研究認為,EMT僅發(fā)生在上皮細胞來源的惡性腫瘤細胞轉移過程中,但隨著研究的深入,有實驗結果證實間質(zhì)來源的肉瘤細胞或干細胞同樣可通過改變EMT相關蛋白的表達增強轉移。研究發(fā)現(xiàn),骨肉瘤轉移患者瘤體組織中相對高表達N-cadherin和Snail蛋白,相對低表達E-cadherin蛋白[150];同時,在多種骨肉瘤細胞系中,細胞可通過調(diào)節(jié)EMT相關蛋白的表達,增強細胞侵襲能力[140],[145],這些結果提示EMT不僅是上皮細胞來源腫瘤轉移的關鍵步驟,人們認為在間質(zhì)細胞來源的骨肉瘤中可能也同樣存在EMT或EMT相關蛋白表達的改變,從而參與了骨肉瘤轉移的形成機制。目前認為EMT的實質(zhì)極有可能是腫瘤細胞通過信號轉導實現(xiàn)獲得轉移能力的一種生命現(xiàn)象[157]。預示著EMT相關蛋白表達變化過程中存在更深層次的轉錄和表觀遺傳變異,因此,需要進一步探討EMT相關蛋白在骨肉瘤細胞轉移中的作用。迄今研究認為,作為吸引白細胞移行到感染部位的一些低分子量的多種趨化因子及相關受體參與了乳腺癌、胃癌、結直腸癌、胰腺導管細胞癌和肝癌等腫瘤細胞的浸潤和轉移[158-159]。骨肉瘤的腫瘤微環(huán)境(tumor microenvironment,TME)中存在大量巨噬細胞[152-153],巨噬細胞可通過分泌TNF-α、TNF-β、IL-lα、IL-1β誘導CXCL6表達[154]。同時,Li[120]等研究發(fā)現(xiàn),CXCL6在骨肉瘤患者的血清中呈現(xiàn)高表達,且體外實驗證實添加重組人CXCL6可顯著促進骨肉瘤細胞的增殖。CXCL6的受體為CXCR1和CXCR2,其與CXCR2的結合力強于CXCR1,并且僅是CXCR2內(nèi)化的強效誘導劑[155]。CXCR2除了參與腫瘤血管生成外,還與多種腫瘤細胞的EMT過程密切相關[121-123]。在CXCR2發(fā)揮促進EMT作用的多條信號通路中,PI3K/Akt相關報道最多。另一方面,β-catenin是經(jīng)典Wnt/β-catenin信號通路的核心,研究發(fā)現(xiàn),β-catenin可與E-cadherin形成復合物,該復合物可調(diào)控EMT,從而在腫瘤細胞增殖、侵襲轉移等過程中發(fā)揮重要的作用。目前認為PI3K/Akt信號通路可通過抑制GSK-3β的活性,從而促進β-catenin的核轉移,即PI3K/Akt信號通路可促進Wnt/β-catenin信號通路活化[147,148]。提示通過研究腫瘤細胞轉移過程中PI3K/Akt信號與其他信號途徑的交互調(diào)控機制,可能為闡明趨化因子調(diào)控骨肉瘤細胞轉移機制提供了新的線索。綜上所述,骨肉瘤的微環(huán)境中存在大量的巨噬細胞,它們可促進腫瘤細胞分泌CXCL6,且骨肉瘤患者血清中CXCL6呈高表達,此外,CXCL6可與具有EMT誘導作用的CXCR2特異性高效結合,由此可推測,趨化因子CXCL6與其受體CXCR2在骨肉瘤發(fā)生發(fā)展過程中,能夠通過調(diào)節(jié)EMT相關蛋白的表達,提高骨肉瘤細胞的遷移、侵襲能力,從而促進骨肉瘤的轉移�；谏鲜龇治�,本課題選擇趨化因子CXCL6與其受體CXCR2為研究對象,探討其對骨肉瘤細胞遷移、侵襲以及EMT相關蛋白的作用,并探究PI3K/Akt、β-catenin信號通路在趨化因子CXCL6介導的轉移中的作用,以期能為骨肉瘤的復發(fā)及轉移的早期診斷和治療提供相關的理論和實踐依據(jù)。本實驗利用轉移能力不同的四種骨肉瘤細胞系,確定趨化因子CXCL6及其受體CXCR2表達與骨肉瘤轉移能力的相關性;利用CXCL6中和抗體,觀察其對轉移能力相對較強的MG63、143B細胞系轉移能力及EMT相關蛋白的影響,確認趨化因子CXCL6及其受體CXCR2與骨肉瘤EMT相關蛋白之間的可能關系;同時,我們利用重組人CXCL6驗證其能否影響轉移能力相對較弱的Sa OS-2、U2OS細胞系的遷移、侵襲及EMT相關蛋白的表達,并在體內(nèi)實驗中進一步驗證趨化因子CXCL6與其受體CXCR2對裸鼠骨肉瘤生長和肺轉移的影響;最后利用PI3K/Akt和β-catenin信號通路阻滯劑、沉默CXCR2探討趨化因子CXCL6與其受體CXCR2引起骨肉瘤患者發(fā)生腫瘤轉移的機制。方法:1.利用TCGA(The Cancer Genome Atlas,癌癥基因組圖譜)中骨肉瘤(Osteosarcoma)的數(shù)據(jù),采用R語言軟件進行統(tǒng)計分析,利用Fisher.test函數(shù)進行Fisher精確檢驗,分析CXCL6、CXCR2m RNA的表達與骨肉瘤患者發(fā)生腫瘤轉移的相關性;2.采用RT-PCR、Western blot法檢測四種骨肉瘤細胞系MG63、143B、Sa OS-2及U2OS細胞中CXCL6、CXCR2的表達情況,并采用Transwell法檢測上述骨肉瘤細胞系的遷移和侵襲能力的強弱與CXCL6表達高低的關系;3.以重組人CXCL6處理骨肉瘤細胞MG63、143B、Sa OS-2及U2OS,利用CCK-8法檢測細胞的存活情況;4.以CXCL6中和抗體處理MG63、143B細胞,利用Transwell法檢測細胞遷移和侵襲情況,應用Western blot法檢測E-cadherin、N-cadherin及Snail蛋白的表達情況,應用免疫熒光檢測E-cadherin和N-cadherin蛋白的表達和分布情況。5.采用si RNA技術沉默Sa OS-2、U2OS細胞中CXCR2,并以重組人CXCL6處理細胞,利用Transwell法檢測細胞遷移和侵襲情況,免疫熒光檢測細胞中E-cadherin、N-cadherin蛋白的表達;Western blot檢測細胞中MMP-9、Snail、phospho-Akt Ser473、Akt、核β-catenin蛋白的表達。應用LY294002和XAV939阻滯PI3K/Akt和β-catenin信號通路,并以重組人CXCL6處理細胞,通過采用Transwell法和Western blot法,考察細胞遷移、侵襲和EMT相關蛋白表達的情況。6.為了驗證CXCL6促進骨肉瘤轉移的作用,我們選取了CXCL6表達與轉移性較低的U2OS細胞,通過慢病毒感染U2OS細胞,構建并篩選高表達CXCL6的U2OS細胞,利用高表達CXCL6的U2OS細胞建立裸鼠皮下荷瘤模型和尾靜脈肺轉移模型。給予裸鼠腹腔注射CXCR2拮抗劑SB225002,利用腫瘤生長曲線、瘤體質(zhì)量、免疫組化法及Western blot法,考察趨化因子CXCL6與其受體CXCR2對腫瘤生長和增殖的調(diào)控作用;利用肺組織HE染色觀察肺轉移情況,考察趨化因子CXCL6與其受體CXCR2對腫瘤轉移的調(diào)控作用。結果:1.提取TCGA(TCGA data version 2016_01_28 for SARC)中同時具有臨床信息與CXCL6和CXCR2m RNA的表達信息的骨肉瘤病例266例,其中175例患者具有轉移的信息,利用Fisher精確檢驗,結果顯示,CXCL6與其受體CXCR2在m RNA表達水平上呈正相關(P=0.0006)。同時,CXCL6m RNA表達與患者發(fā)生轉移顯著相關(P=0.009645)。2.四種骨肉瘤細胞株中CXCL6、CXCR2在基因水平和蛋白水平均呈高表達,同時,CXCL6表達越高,細胞的遷移和侵襲能力越強。3.CCK-8檢測結果顯示,重組人CXCL6(100ng/ml)處理MG63、143B、Sa OS-2及U2OS細胞48h后,與空白對照組相比較,細胞增殖能力明顯增強(P㩳0.05)。4.CXCL6中和抗體能夠降低骨肉瘤細胞MG63、143B遷移和侵襲能力,同時使細胞中EMT相關蛋白Snail、N-cadherin的表達明顯降低,E-cadherin蛋白的表達明顯的升高。5.在CXCR2基因沉默后,重組人CXCL6促進Sa OS-2、U2OS細胞的遷移和侵襲的效果明顯降低,同時EMT相關蛋白E-cadherin、N-cadherin以及信號通路相關蛋白p-Akt/Akt和核β-catenin的相對表達量受重組人CXCL6的影響也顯著減小;加入LY294002和XAV939信號通路阻滯劑后,Sa OS-2、U2OS細胞中MMP-9、Snail和N-cadherin的表達明顯減少,E-cadherin的表達顯著增加。6.動物實驗結果顯示,皮下注射CXCL6高表達的U2OS細胞可促進腫瘤的生長及瘤體中的增殖細胞核抗原(Proliferating Cell Nuclear Antigen,PCNA)、p-Akt/Akt及胞核β-catenin蛋白等的表達,而注射CXCR2拮抗劑后,細胞增殖蛋白PCNA、p-Akt/Akt和胞核β-catenin蛋白的相對表達量均降低。在肺轉移模型中,CXCL6可顯著促進腫瘤細胞肺轉移,注射CXCR2拮抗劑后,肺部轉移灶明顯減少。高表達CXCL6能夠增加成瘤率與肺部轉移率,同時,增加肺部組織轉移灶的形成;給予CXCR2拮抗劑后,雖然肺部轉移率并未見明顯變化,但是,其病理學實驗結果顯示肺部組織轉移灶的形成明顯減少。結論:1通過TCGA數(shù)據(jù)分析以及趨化因子CXCL6差異表達的四種骨肉瘤細胞遷移、侵襲實驗檢測,我們推測骨肉瘤趨化因子CXCL6的表達可能與轉移能力有關;2利用CXCL6中和抗體或沉默趨化因子受體CXCR2能夠抑制骨肉瘤細胞趨化因子CXCL6介導的轉移能力,并改變EMT相關蛋白的表達。表明趨化因子CXCL6與其受體CXCR2結合,可以調(diào)控EMT相關蛋白的表達,從而引起骨肉瘤細胞發(fā)生轉移。3用PI3K/Akt和β-catenin信號通路阻滯劑能夠阻斷趨化因子CXCL6引起的EMT相關蛋白表達。提示趨化因子CXCL6與其受體CXCR2可能通過調(diào)控PI3K/Akt和β-catenin信號通路,引起EMT相關蛋白表達的變化,參與了骨肉瘤轉移的機制。4體內(nèi)實驗驗證了趨化因子CXCL6與其受體CXCR2能夠影響骨肉瘤在裸鼠皮下生長與肺轉移,進一步支持趨化因子CXCL6與其受體CXCR2通過調(diào)控PI3K/Akt與β-catenin信號通路參與了骨肉瘤的轉移。
【學位授予單位】：吉林大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R738.1
【圖文】：

吉林大學博士學位論文接毗鄰的區(qū)域,從而形成繼發(fā)腫瘤的過程 在原發(fā)部 Tumor），相對于原發(fā)瘤而言，在遠隔部位生長r） 最新研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤細胞可以依靠血管趨向性機剖結構的外表面持續(xù)遷移進行擴散，逃避化療藥腫瘤轉移不但是惡性腫瘤的重要生物學特征，也是更是近年來癌癥臨床治療的主要瓶頸[21] 目前，探方法已成為治療癌癥的研究熱點

igure 1.2 Steps in the development of tumor metastas（引自文獻[22]）圖 1.2 腫瘤轉移的步驟腫瘤轉移影響因素移與腫瘤的發(fā)生一樣，是一個多因素相互作用ǐ各步驟相互細胞轉移的分子機制非常復雜，至今仍對其了解甚少，下面綜述 力作用惡性腫瘤細胞的快速生長和不斷增殖，導致腫瘤體積逐漸增壓力的增加有利于瘤體表面的細胞向壓力低的方向侵襲，并隙做平面上的和空間內(nèi)的浸潤 由此可見，原發(fā)瘤的壓力作離出來提供了有利條件[23] 附作用分子（Cell adhesion molecules，CAMs）是一類由細胞產(chǎn)生，

吉林大學博士學位論文L6 中和抗體對骨肉瘤細胞遷移ǐ侵襲的影響ELISA 檢測 143B 和 MG63 細胞上清中 CXCL6 的基礎含量 143B 細胞上清中 CXCL6 的基礎含量隨著細胞培養(yǎng)時間的延長量從 409.855±40.859pg/ml 上升到 8996.661±946.288pg/ml，MG6 基 礎 含 量 在 0h-96h 內(nèi) 含 量 從 217.602±22.271pg/m65.320pg/ml，如 Figure 2.5 結合參考文獻和抗體說明書，根據(jù)加入 CXCL6 中和抗體 10μg/ml，進行后續(xù)實驗

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本文編號：2790816