【摘要】：骨肉瘤是源自間充質(zhì)組織的惡性腫瘤,其主要發(fā)生在青少年中,由于其侵襲性生長及早期的肺部轉(zhuǎn)移,導(dǎo)致其預(yù)后較差。既往的治療措施多為患肢截肢以及術(shù)后的放、化療,但5年生存率仍小于20%,近年來臨床上所采用的新輔助化療聯(lián)合保肢手術(shù)使得患者的預(yù)后出現(xiàn)明顯的改善,患者的生存質(zhì)量也顯著提高,但是在進行化學(xué)治療時常會導(dǎo)致誘導(dǎo)抗藥細胞的出現(xiàn)以及許多病人因化學(xué)抗癌藥的毒副作用不得不終止治療,使得部分患者的預(yù)后仍不樂觀。為此,針對骨肉瘤的特點及基因特異性,誕生了一些靶向藥物,并發(fā)現(xiàn)了相關(guān)的基因靶點,部分藥物如Endostar等也已投入臨床進行使用,并發(fā)揮了較好地腫瘤治療效果,以上理論使骨肉瘤的臨床治療進入了精準治療的新時代。通過聯(lián)合這些新型的靶向藥物以及針對這些相關(guān)的基因位點進行作用,使得既往對骨肉瘤而言較為不敏感的放射治療成為了治療的新手段。近年的研究證實,多種基因與骨肉瘤的放射敏感性有關(guān)。C Blattmann等人通過研究組蛋白去乙�；敢种苿�,發(fā)現(xiàn)抑制組蛋白去乙�；负�,研究中所選取的兩種骨肉瘤細胞系(KHOS-240S和SAOS2)以及兩種橫紋肌肉瘤細胞系(A-204和RD)都顯示出對放射治療的顯著敏感性增強,與對照組相比,實驗組細胞在增殖與凋亡等生物特性方面出現(xiàn)了顯著差異。N Chen則證實通過敲除Autophagy蛋白-5途徑沉默NRF2可使骨肉瘤細胞系U20S對放射治療的抵抗性消失,相關(guān)基因及蛋白如p65、Bcl-2表達水平降低,而p53及Bax表達升高,并最終證實其相應(yīng)的細胞通路為ERK 1/2通路。而FB Mantovani等也通過對表皮生長因子受體(Epidermal growth factor receptor,EGFR)進行研究,證實其通過VEGF等相關(guān)靶點作用于PKB/Akt信號通路增強了骨肉瘤細胞對射線的敏感性,其放療增敏效應(yīng)在體內(nèi)及體外實驗研究中均得到了驗證。經(jīng)過近年來的基礎(chǔ)及臨床實驗,研究者們發(fā)現(xiàn)了眾多與放療敏感性相關(guān)的基因位點及相關(guān)通路,在這種背景下,我們對泛素偶聯(lián)酶2T(ubiquitin-conjugating enzyme T,UBE2T)基因與骨肉瘤放射治療敏感性的關(guān)系進行了研究。UBE2T基因?qū)儆诜核亟Y(jié)合酶家族中的一員,而泛素蛋白酶體途徑是蛋白降解的主要途徑,也是惡性腫瘤侵襲及轉(zhuǎn)移的重要步驟之一,在此過程中,泛素通過泛素激活酶(E1)、泛素偶聯(lián)酶(E2)以及泛素連接酶(E3)三個步驟轉(zhuǎn)移至底物蛋白上,對底物蛋白進行識別及分解。既往研究證實泛素偶聯(lián)酶在腫瘤的放療增敏中有著重要作用。一項關(guān)于宮頸癌放射治療的研究證實,通過沉默泛素偶聯(lián)酶C(UBE2C)可使SiHa以及HeLa細胞系對放射治療的敏感性增強,原本是宮頸癌中放療抵抗效應(yīng)最顯著的SiHa細胞也對放射治療表現(xiàn)出了極高的敏感性,與對照組相比,細胞的增殖及侵襲性出現(xiàn)顯著降低。而另一項關(guān)于乳腺癌的研究則證實:乳腺癌細胞中UBE2C基因表達較癌旁細胞顯著為高,而通過沉默UBE2C則增強了乳腺癌細胞HBL100以及HEK293T對放療、三氧苯胺、他莫昔芬以及來曲唑的敏感性,進一步證實了 UBE2C在放療增敏過程中的作用。其它關(guān)于乳腺癌的研究也得到了上述結(jié)論:沉默UBE2C可促進乳腺癌的放療增敏作用。UBE2T是泛素偶聯(lián)酶家族中的重要一員,在上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化及間質(zhì)-上皮轉(zhuǎn)化中起著重要作用,其在多種腫瘤的生長、侵襲、轉(zhuǎn)移中也被發(fā)現(xiàn)是重要的相關(guān)基因靶點,如肺癌、乳腺癌、胃癌等,近期的研究也證實UBE2T在骨肉瘤的生長及侵襲中也發(fā)揮了重要作用。在上述背景之下,并結(jié)合近期的研究結(jié)果,我們認為UBE2T可能也在相關(guān)腫瘤的放療增敏中扮演著重要角色,因此我們選擇UBE2T作為研究目標及靶點并對其在骨肉瘤細胞中的放療增敏作用進行了研究,同時評價了 UBE2T聯(lián)合放射治療對于骨肉瘤細胞肺轉(zhuǎn)移的作用。本研究通過臨床和基礎(chǔ)相結(jié)合的手段,首先評價了 UBE2T在發(fā)生肺轉(zhuǎn)移及非肺轉(zhuǎn)移的骨肉瘤患者中的表達情況,并對其在多種骨肉瘤細胞株中的表達情況進行研究,然后構(gòu)建了 UBE2T沉默慢病毒載體,觀察其聯(lián)合放射治療對骨肉瘤細胞增殖、遷移的作用,同時在體內(nèi)構(gòu)建荷瘤小鼠模型,以評估此種聯(lián)合療法對腫瘤生長和肺轉(zhuǎn)移的影響,最終證實UBE2T在骨肉瘤生長和肺轉(zhuǎn)移的放射增敏中起著重要作用,為下一步骨肉瘤基因聯(lián)合放療奠定基礎(chǔ),同時為臨床轉(zhuǎn)移性骨肉瘤的診斷和治療提供了新的可能靶點。第一章UBE2T在人骨肉瘤標本及人骨肉瘤細胞系中的表達情況研究研究目的:研究人骨肉瘤標本切片癌組織與癌旁組織中UBE2T的表達情況,同時比較肺轉(zhuǎn)移及非肺轉(zhuǎn)移骨肉瘤患者的癌組織中UBE2T表達情況,從臨床層面確定UBE2T在骨肉瘤中的表達;同時對四種骨肉瘤細胞系進行UBE2T的表達研究,確定其在骨肉瘤細胞系中的表達豐度。研究方法:1.采用免疫組化的方法對在臨床收集的骨肉瘤患者的標本進行研究,分析癌組織與癌旁組織中UBE2T的表達情況,同時比較肺轉(zhuǎn)移及非肺轉(zhuǎn)移骨肉瘤患者的癌組織中UBE2T表達情況,確定UBE2T與骨肉瘤侵襲性的聯(lián)系。2.采用q-PCR的方法檢測骨肉瘤細胞系U20S、Saos-2、MG-63、HOS中的表達豐度。研究結(jié)果:1.UBE2T在骨肉瘤患者的癌組織中表達呈陽性,癌旁組織中呈陰性;2.在出現(xiàn)肺轉(zhuǎn)移的患者中,其原位骨肉瘤組織的UBE2T表達水平顯著高于非肺轉(zhuǎn)移的骨肉瘤患者;3.UBE2T在U20S、Saos-2、MG-63、HOS四種骨肉瘤細胞系中均呈高豐度表達,其中在USOS中表達豐度為最高。研究結(jié)論:通過在癌組織與癌旁組織的表達情況比較以及在肺轉(zhuǎn)移患者與非肺轉(zhuǎn)移患者中表達情況的比較,我們認為UBE2T與骨肉瘤的侵襲性及肺轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)。第二章SiRNA-UBE2T對骨肉瘤細胞U20S生長及遷移的放療增敏作用研究目的:構(gòu)建UBE2T干擾慢病毒載體(SiRNA-UBE2T),評價其聯(lián)合放射治療在骨肉瘤細胞系U20S體外生長、克隆及遷移中的作用。研究方法:1.采用分子生物學(xué)及細胞生物學(xué)手段構(gòu)建UBE2T干擾慢病毒載體(SiRNA-UBE2T),并對骨肉瘤細胞U20S進行感染,采用q-PCR及WesternBlot手段測定其對UBE2T表達敲減情況的作用。2.將骨肉瘤細胞 U20S 進行分組(SiRNA-Ctrl、SiRNA-UBE2T、SiRNA-Ctrl 聯(lián)合放射治療組(IR+SiRNA-Ctrl)以及SiRNA-UBE2T聯(lián)合放射治療組(IR+SiRNA-UBE2T))治療,利用Celigo細胞計數(shù)法、CCK-8評價U20S細胞的增殖情況,利用平板克隆形成實驗評價U20S克隆形成情況,利用細胞劃痕實驗驗證聯(lián)合治療后U20S的遷移情況,利用流失細胞儀測定各組細胞的凋亡情況。研究結(jié)果:1.成功構(gòu)建了 UBE2T干擾慢病毒載體(SiRNA-UBE2T),其可使U20S中UBE2T的表達顯著降低;2.SiRNA-UBE2T聯(lián)合放射治療組中,U20S細胞的增殖、克隆以及遷移速度較其他3組顯著降低,而凋亡率較其他三組顯著為高。研究結(jié)論:SiRNA-UBE2T聯(lián)合放射治療可在體外顯著降低U20S細胞的增殖、克隆以及遷移速度,并促進其凋亡。第三章SiRNA-UBE2T對小鼠體內(nèi)骨肉瘤生長及肺轉(zhuǎn)移的放療增敏作用研究目的:構(gòu)建U20S荷瘤小鼠模型,評價SiRNA-UBE2T聯(lián)合放射治療對原位腫瘤生長及肺轉(zhuǎn)移的作用,并初步探討其作用靶點及機制。研究方法:1購買重癥聯(lián)合免疫缺陷小鼠(SCID),并在其背部進行骨肉瘤細胞皮下接種,構(gòu)建SCID荷瘤模型。2.將小鼠進行分組(SiRNA-Ctrl、SiRNA-UBE2T、IR+SiRNA-Ctrl 組以及 IR+SiRNA-UBE2T組)治療,評價小鼠原位腫瘤生長情況,并在其處死后觀察其肺轉(zhuǎn)移、肺濕重等情況。3.采用免疫組化手段評價波形蛋白(Vimentin)與凋亡相關(guān)蛋白(Bax、Caspase-3)在各組腫瘤中表達情況。研究結(jié)果:1.IR+ SiRNA-UBE2T組中小鼠腫瘤顯著較其他3組為小,并在第6周出現(xiàn)腫瘤減小的趨勢,且本組小鼠中均未出現(xiàn)肺轉(zhuǎn)移情況的發(fā)生;2.SiRNA-UBE2T聯(lián)合放射治療組中,Vimentin表達水平最低,而Bax、Caspase-3表達水平最高;研究結(jié)論:SiRNA-UBE2T聯(lián)合放射治療可顯著減弱小鼠骨肉瘤的生長并降低肺轉(zhuǎn)移機率,SiRNA-UBE2T可對小鼠的骨肉瘤呈現(xiàn)放療增敏的作用,其作用機制可能是通過Vimentin及Bax、Caspase-3等實現(xiàn)。
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R738
【圖文】：

圖１．２四種骨肉瘤細胞系中ＵＢＥ２Ｔ的ＡＣｔ數(shù)值逡逑

圖２．１邋ｓｈＣｔｒｌ及ｓｈＵＢＥ２Ｔ轉(zhuǎn)染Ｕ２０Ｓ細胞后明視野及熒光視野圖像（１００ｘ）逡逑（２．邋１－Ａ邋ｓｈＣｔｒｌ邋明視野；２．１－Ｂ邋ｓｈＣｔｒｌ邋熒光視野邋１００ｘ；邋２．邋１－Ｃ邋ｓｈＵＢＥ２Ｔ邋明視逡逑野；２．１－Ｄ邋ｓｈＵＢＥ２Ｔ熒光視野）逡逑

附圖：逡逑ｍｍ逡逑■■逡逑圖２．１邋ｓｈＣｔｒｌ及ｓｈＵＢＥ２Ｔ轉(zhuǎn)染Ｕ２０Ｓ細胞后明視野及熒光視野圖像（１００ｘ）逡逑（２．邋１－Ａ邋ｓｈＣｔｒｌ邋明視野；２．１－Ｂ邋ｓｈＣｔｒｌ邋熒光視野邋１００ｘ；邋２．邋１－Ｃ邋ｓｈＵＢＥ２Ｔ邋明視逡逑野；２．１－Ｄ邋ｓｈＵＢＥ２Ｔ熒光視野）逡逑１．２００邋｜邐

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本文編號：2779259