【摘要】：[背景]缺血再灌注損傷(ischemia reperfusion injurry,IRI)是出現(xiàn)在肝臟移植手術(shù)中常見的病理生理過程,細(xì)胞在缺血缺氧過程中發(fā)生溶解、凋亡,嚴(yán)重影響了移植肝功能。早期再灌注損傷機(jī)制包括Kupffer細(xì)胞活化、肝細(xì)胞膨脹及肝臟微循環(huán)功能障礙,而肝竇內(nèi)皮細(xì)胞(liver sinusoidal endothelial cells,LSEC)在調(diào)節(jié)肝臟微循環(huán)中占據(jù)了主要地位。研究表明,在肝臟IRI時(shí)LSEC是最先發(fā)生功能異常的細(xì)胞,早期LSEC結(jié)構(gòu)和功能的損傷是構(gòu)成肝臟IRI病理發(fā)生發(fā)展的基礎(chǔ)。因此,有效的保護(hù)LSEC活性和功能是減輕IRI的關(guān)鍵。近年來,具有細(xì)胞保護(hù)作用的血紅素氧合酶-1(heme oxygenase 1,HO-1)成為了研究熱點(diǎn)。HO-1亦稱熱休克蛋白32,作為細(xì)胞氧化應(yīng)激最敏感的指標(biāo),在炎癥、缺氧、放射等損傷過程中,通過上調(diào)表達(dá)量調(diào)節(jié)細(xì)胞促炎因子釋放和抑制細(xì)胞凋亡,從而發(fā)揮細(xì)胞保護(hù)作用。以往研究表明,誘導(dǎo)HO-1高表達(dá)能夠顯著減輕肝臟缺血再灌注損傷,其機(jī)制之一可能是通過抑制Kupffer細(xì)胞分泌炎癥介質(zhì)及抗細(xì)胞凋亡等作用保護(hù)肝臟。但現(xiàn)階段關(guān)于LSEC在肝臟缺血再灌注損傷中表達(dá)HO-1的情況尚不清楚,特別是HO-1對(duì)LSEC保護(hù)作用的研究尚未見報(bào)道。[目的]本研究采用HO-1過表達(dá)腺病毒載體行小鼠LSEC體外轉(zhuǎn)染,通過“低血清、缺氧-復(fù)氧”培養(yǎng)方法建立體外小鼠LSEC缺血再灌注損傷模型,探討LSEC缺氧-復(fù)氧損傷后,HO-1對(duì)LSEC的保護(hù)作用。[方法]1、實(shí)驗(yàn)分組:將LSEC隨機(jī)分為以下6組,空載體腺病毒轉(zhuǎn)染組(enhanced green fluorescent protein group,EGFP 組);HO-1 腺病毒轉(zhuǎn)染組(heme oxygenase 1 group,HO-1組);空白對(duì)照組(control group,細(xì)胞不進(jìn)行任何腺病毒轉(zhuǎn)染),將以上三組接受不同干預(yù)的細(xì)胞分別進(jìn)行缺氧-復(fù)氧(H-R)培養(yǎng)和常氧(Normoxia)培養(yǎng),即 H-R 干預(yù)下的 control、EGFP 和 HO-1 組;Normoxia 干預(yù)下的 control、EGFP 和 HO-1 組。2、腺病毒轉(zhuǎn)染效率檢測(cè):選取生長(zhǎng)匯合度達(dá)80%～90%的LSEC分別進(jìn)行空載體腺病毒轉(zhuǎn)染和HO-1高表達(dá)腺病毒轉(zhuǎn)染。在轉(zhuǎn)染48小時(shí)后,用倒置熒光顯微鏡觀察細(xì)胞轉(zhuǎn)染后的熒光顯色及轉(zhuǎn)染效率;用RT-qPCR和Western blot檢測(cè)細(xì)胞轉(zhuǎn)染后HO-1的mRNA和蛋白表達(dá)水平。3、模型建立:當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)匯合大于80%時(shí),更換低血清(5%)細(xì)胞培養(yǎng)基,將細(xì)胞放于37℃,N2體積分?jǐn)?shù)為95%、C02體積分?jǐn)?shù)為5%的混合氣體培養(yǎng)箱中進(jìn)行缺氧培養(yǎng)6小時(shí),隨后放回37℃,空氣體積為95%、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的混合氣體培養(yǎng)箱中進(jìn)行復(fù)氧培養(yǎng)24小時(shí),完成LSEC體外缺血再灌注損傷模型的建立�？瞻讓�(duì)照組置于常氧細(xì)胞培養(yǎng)箱(37℃,空氣體積分?jǐn)?shù)95%、C02體積分?jǐn)?shù)5%)中培養(yǎng)。4、ELISA檢測(cè)細(xì)胞因子釋放:實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ徒⑼瓿珊?收集細(xì)胞培養(yǎng)液,.離心后選取培養(yǎng)上清液,根據(jù)小鼠ELISA試劑盒分別進(jìn)行IL-6、TNF-α表達(dá)水平檢測(cè)。5、流式細(xì)胞學(xué)檢測(cè)細(xì)胞凋亡:實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ徒⑼瓿珊?棄去細(xì)胞培養(yǎng)液,加入Annexin V/Alexa Fluor647檢測(cè)試劑,通過流式細(xì)胞分析儀進(jìn)行LSEC凋亡率檢測(cè)。.6、CCK-8檢測(cè)細(xì)胞活性:根據(jù)CCK-8細(xì)胞活性檢測(cè)試劑盒操作說明,對(duì)完成缺氧-復(fù)氧損傷后的LSEC活性進(jìn)行檢測(cè)。7、RT-qPCR法檢測(cè):檢測(cè)小鼠LSEC中HO-1mRNA水平的表達(dá)量。8、Western blot法檢測(cè):檢測(cè)小鼠LSEC中HO-1蛋白水平的表達(dá)量。9、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析:所有數(shù)據(jù)采用Windows XP操作系統(tǒng),SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)分析軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,組間差異采用雙因素方差分析,均數(shù)之間用獨(dú)立樣本的t檢驗(yàn)。結(jié)果用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤(x±SEM)表示,以P0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。[結(jié)果]1、腺病毒轉(zhuǎn)染效率:HO-1高表達(dá)腺病毒在最佳劑量(MOI=80)轉(zhuǎn)染LSEC時(shí),轉(zhuǎn)染效率大于80%,且細(xì)胞形態(tài)保持穩(wěn)定,并能在LSEC中顯著表達(dá)HO-1 mRNA和蛋白,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。2、ELISA 檢測(cè)結(jié)果:H-R 干預(yù)組(control、EGFP 和 HO-1 組)LSEC 的 IL-6和TNF-α水平都高于Normoxia干預(yù)組(control、EGFP和HO-1組),(每組n =6,*P0.05 和**P0.01)。與 EGFP 組相比,HO-1 組上清液的 IL-6 和 TNF-α水平顯著降低(###P0.001)。3、流式細(xì)胞檢測(cè)細(xì)胞凋亡結(jié)果:HO-1組相比于EGFP組(H-R干預(yù)后)凋亡細(xì)胞數(shù)量減少(每組n = 3,**P0.01)。4、CCK-8檢測(cè)細(xì)胞活性結(jié)果:EGFP和HO-1組的細(xì)胞活力低于對(duì)照組(每組n = 5,**P0.01和***P0.001)。在受到H-R干預(yù)后的細(xì)胞中,HO-1組與EGFP組相比,觀察到HO-1組的細(xì)胞活力顯著增加(**P0.01)。5、RT-qPCR檢測(cè)結(jié)果:與對(duì)照組和EGFP組相比,用Ad-HO-1轉(zhuǎn)染LSEC的HO-1mRNA表達(dá)水平顯著上調(diào)。在HR干預(yù)組(control、EGFP和HO-1組)中HO-1mRNA的表達(dá)水平顯著下調(diào)(每組n = 6組,WP0.001)。H-R干預(yù)后,所有H-R干預(yù)組HO-1 mRNA水平顯著低于Normoxia干預(yù)組。6、Western blot檢測(cè)結(jié)果:在轉(zhuǎn)染Ad-HO-1基因后HO-1組LSEC的HO-1表達(dá)上調(diào),而H-R干預(yù)組與Normoxia干預(yù)組(control、EGFP組和HO-1組)比較,HO-1 表達(dá)明顯下調(diào)(每組n = 3,*P0.05,**P0.01,***P0.001)。[結(jié)論]1、腺病毒載體體外轉(zhuǎn)染小鼠LSEC高表達(dá)HO-1的方法具有可行性和穩(wěn)定性;“低血清、缺氧-復(fù)氧”培養(yǎng)法小鼠LSEC體外缺血再灌注損傷模型符合臨床肝臟缺血再灌注損傷病理生理過程,是一種穩(wěn)定性和可操作性強(qiáng)的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ汀?、缺氧-復(fù)氧損傷模型所致的細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)可降低LSEC中HO-1的表達(dá),具體機(jī)制尚不清楚,可能與LSEC超微結(jié)構(gòu)破壞導(dǎo)致肝臟微循環(huán)衰竭有關(guān)。3、HO-1可通過抑制細(xì)胞促炎因子釋放、減少細(xì)胞凋亡,從而減輕LSEC缺氧-復(fù)氧損傷,起到保護(hù)LSEC的作用。
【學(xué)位授予單位】：昆明醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R657.3
【圖文】：

圖１．離心后產(chǎn)生的小鼠邐

：逡逑Ｔｒｉｓ邐０．６０５邋ｌｇ逡逑甘氨酸邐２．８８２６ｇ逡逑甲醇邐４０ｍｌ逡逑加水至邐２００ｍｌ逡逑６）ＴＢＳＴ邋緩沖液：２０％Ｔｗｅｅｎ２０，邋１．１８ｍｌ，加入邋ＴＢＳ邋緩沖液至邋５００ｍｌ。逡逑２．２小鼠肝竇內(nèi)皮細(xì)胞（ＬＳＥＣ）培養(yǎng)逡逑原代Ｃ５７ＢＬ／６小鼠ＬＳＥＣ購(gòu)自ｉＣｅｌｌ公司。購(gòu)買來的原代小鼠ＬＳＥＣ生長(zhǎng)于逡逑２５ｃｍ２培養(yǎng)瓶中，將細(xì)胞消化離心后底層的ＬＳＥＣ接種到６孔細(xì)胞培養(yǎng)板中貼壁逡逑培養(yǎng)（圖１、２、３），向每孔內(nèi)加入原代內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基，培養(yǎng)在３７°Ｃ，９５％空逡逑氣、５％Ｃ０２的培養(yǎng)箱中，并且每２４小時(shí)更換培養(yǎng)基。在原代培養(yǎng)２至３天后對(duì)逡逑細(xì)胞進(jìn)行腺病毒轉(zhuǎn)染及缺氧－復(fù)氧（Ｈ－Ｒ）模型建立。逡逑

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【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2772481