【摘要】：目的:探討體外轉(zhuǎn)染慢病毒介導(dǎo)的MMP3(metal matrix loproteinase 3)、SOX9(SRY2related high mobility group box gene 9)基因后對轉(zhuǎn)染的人椎間盤退變髓核細(xì)胞產(chǎn)生的生物學(xué)效應(yīng)。方法:篩選合適的腰椎間盤突出人群,選取需要手術(shù)治療的患者,在進(jìn)行手術(shù)時(shí)將切除的椎間盤髓核組織及時(shí)的分辨、保存,并用酶序貫消化的方法分離,并單層原代細(xì)胞培養(yǎng)(已完成相關(guān)課題),然后將退變的人椎間盤髓核細(xì)胞進(jìn)行復(fù)蘇、培養(yǎng)及鑒定。構(gòu)建慢病毒介導(dǎo)SOX9載體、慢病毒介導(dǎo)MMP3-siRNA載體,慢病毒載體感染人椎間盤退變髓核細(xì)胞,并觀察轉(zhuǎn)染效力及轉(zhuǎn)染對人椎間盤退變髓核細(xì)胞增殖的影響。RT-PCR技術(shù)檢測人退變椎間盤髓核細(xì)胞內(nèi)蛋白多糖、Ⅱ型膠原蛋白的mRNA相對表達(dá)量。Western Blot檢測人退變椎間盤髓核細(xì)胞內(nèi)蛋白多糖、Ⅱ型膠原蛋白的相對表達(dá)量。結(jié)果:1.復(fù)蘇培養(yǎng)的人退變髓核細(xì)胞,原代培養(yǎng)的髓核細(xì)胞形態(tài)呈現(xiàn)不規(guī)則的變化,有三角形、四角形、短梭形等形狀改變,細(xì)胞核較正常變大。2.免疫熒光測定慢病毒的轉(zhuǎn)染效力,轉(zhuǎn)染效率較高,可達(dá)到80-90%。3.MTT法顯示:空白組與MMP3-siRNA/SOX9慢病毒空載體轉(zhuǎn)染組生長情況沒有明顯差異;MMP3-siRNA基因干擾沉默組、SOX9過表達(dá)組促進(jìn)髓核細(xì)胞增殖的作用與空白組、空載體組有明顯差異,而且在共同轉(zhuǎn)染MMP3-siRNA、過表達(dá)SOX9后,人退變髓核細(xì)胞增殖效果更加明顯。4.Q-PCR檢測顯示:MMP3基因沉默后人退變髓核細(xì)胞分泌蛋白多糖、Ⅱ型膠原蛋白較對照組增加(P0.05);SOX9過表達(dá)后人椎間盤退變髓核細(xì)胞分泌蛋白多糖、Ⅱ型膠原蛋白較對照組增加(P0.05);共轉(zhuǎn)染MMP3-siRNA、過表達(dá)SOX9后,人椎間盤退變髓核細(xì)胞分泌蛋白多糖、Ⅱ型膠原蛋白能力最強(qiáng)。5.Western Blot結(jié)果顯示:MMP3基因沉默后人椎間盤退變髓核細(xì)胞分泌蛋白多糖、Ⅱ型膠原蛋白較對照組增加(P0.05);SOX9過表達(dá)后人椎間盤退變髓核細(xì)胞分泌蛋白多糖、Ⅱ型膠原蛋白較對照組增加(P0.05);共轉(zhuǎn)沉默MMP3-siRNA、過表達(dá)SOX9后,人椎間盤退變髓核細(xì)胞分泌蛋白多糖、Ⅱ型膠原蛋白能力增強(qiáng)最為明顯。結(jié)論:通過分子生物學(xué)手段進(jìn)行MMP3基因沉默或促使SOX9基因過度表達(dá)均能促進(jìn)退變椎間盤髓核細(xì)胞發(fā)生分裂增殖,并能提升退變髓核細(xì)胞對蛋白多糖和Ⅱ型膠原蛋白的分泌能力,即MMP3基因和SOX9基因有希望成為阻止人類椎間盤退變的新靶點(diǎn)。
【學(xué)位授予單位】：青島大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R681.5
【圖文】：

青島大學(xué)碩士學(xué)位論文實(shí)驗(yàn)結(jié)果變髓核細(xì)胞的復(fù)蘇及細(xì)胞鑒別代人椎間盤髓核退變細(xì)胞在接種后，在倒置顯微鏡下觀察，可發(fā)現(xiàn)細(xì)，有的形態(tài)不規(guī)則，細(xì)胞大小不等，懸浮在培養(yǎng)液內(nèi)，4～6 天后，發(fā)在培養(yǎng)管壁。開始貼壁的細(xì)胞形態(tài)改變明顯，呈類圓形、團(tuán)簇狀生長出偽足，呈現(xiàn)多角形、三角形、短梭形或梭形，細(xì)胞核變大，核仁明核，且胞漿內(nèi)可發(fā)現(xiàn)分泌顆粒，細(xì)胞的折光性良好；當(dāng)髓核細(xì)胞全部胞探出偽足，互相連接，呈片狀。如圖 1.1 所示，在培養(yǎng) 14d 后，可胞相互匯合，并有基質(zhì)樣物質(zhì)沉淀在細(xì)胞的周圍（圖 A）。在培養(yǎng)約 核細(xì)胞匯合率可達(dá) 80%以上(圖 B)。A B

原代髓核細(xì)胞匯合率可達(dá) 80%以上(圖 B)。A B圖 1.1 復(fù)蘇培養(yǎng)的人椎間盤退變髓核細(xì)胞（X 400）注：A 圖示培養(yǎng) 14 天后鏡下所見；圖 B 示培養(yǎng) 21 天后鏡下所見。提取培養(yǎng)的人髓核細(xì)胞，進(jìn)行蘇木精-伊紅染色，顯微鏡下觀察，髓核細(xì)胞出現(xiàn)短梭形、多角形、三角形等形狀改變，形態(tài)變化不規(guī)則，部分細(xì)胞核出現(xiàn)偏心現(xiàn)象，偏向胞壁的一側(cè)，細(xì)胞核染色呈藍(lán)色，細(xì)胞漿染色呈淡紅色，離胞核越遠(yuǎn)，胞漿染色越淺（如圖 2.1 所示）。A B C

實(shí)驗(yàn)結(jié)果 免疫熒光測定轉(zhuǎn)染效力設(shè)計(jì)不同梯度的病毒液濃度，將病毒液 Lentivirus-NC （1×108TU/ml）稀釋至 3不同濃度，分別轉(zhuǎn)染人退變的椎間盤髓核細(xì)胞，于 72 小時(shí)后，顯微鏡下觀察綠色光表達(dá)及細(xì)胞的狀態(tài)（如圖 2.1 所示）。結(jié)果為：病毒濃度為 1×108TU/ml 時(shí)，對退變髓核細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率在 80%左右，細(xì)胞的狀態(tài)尚好。感染復(fù)數(shù)（ MOI）指在染時(shí)病毒數(shù)量和細(xì)胞數(shù)量的比例值。(A MMP3 沉默組、B SOX9 過表達(dá)組) 。10稀釋轉(zhuǎn)染效力高于 100 倍與 1000 倍稀釋，轉(zhuǎn)染 72 小時(shí)后，轉(zhuǎn)染效率最高的是 1:10釋倍數(shù)組，明顯高于其他兩組，由此計(jì)算分析得出，當(dāng) MOI=43 時(shí)，病毒轉(zhuǎn)染效最高。10 倍稀釋 100 倍稀釋 1000 倍稀釋

【參考文獻(xiàn)】

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1 譚樹森;賈長青;劉振寧;劉瑞端;楊杰;張磊;壽奮勇;鞠曉軍;;經(jīng)超順磁性氧化鐵標(biāo)記的自體BMSCs在兔椎間盤內(nèi)存活時(shí)間研究[J];中國修復(fù)重建外科雜志;2009年11期

2 陳金武,吳軍正,李焰,劉斌;sox9基因過表達(dá)誘導(dǎo)人骨髓基質(zhì)干細(xì)胞向軟骨細(xì)胞分化[J];臨床口腔醫(yī)學(xué)雜志;2003年12期

本文編號：2769606